Q1：HiCuT的详细实验步骤
在HiCuT实验中，首先参考Hi-C 3.0策略，对样本进行双交联、双酶切、补平和连接。
• 对样本进行交联时，使用可以交联到不同空间距离的两种试剂，相对单交联而言，双交联可以固定更多的互作；
• 裂解细胞后，使用两种四碱基酶进行酶切，双交联和双酶切处理能兼顾获得近距离和远距离的空间互作；
• 酶切后将黏性末端补为平末端，不添加生物素可以获得更多的DNA满足上机测序并降低PCR冗余；
• 利用DNA连接酶连接平末端，生成嵌合DNA片段。
之后则按照CUT&Tag步骤进行后续实验，包括ConA beads结合细胞、孵育一抗、二抗、pA/G-Tn5融合蛋白、转座、解交联、回收DNA并扩增，构建完成HiCuT文库。
Q2：HiCuT的分析内容
HiCuT采用了Hi-C和CUT&Tag实验策略，因此HiCuT数据质控会同时关注顺反互作及不同距离的顺式互作比例、TSS富集效果、Peaks数量等。数据分析中，重点是关注anchor两端均有peak的loop，获得调控元件参与的互作。然后对相关基因进行GO/KEGG富集分析，研究基因参与的功能，还可以对loop上的peak序列进行Motif扫描及富集分析，鉴定潜在的参与互作的转录因子等调控蛋白。
Q3：选择HiCuT实验的一抗时有什么需要注意的要点呢？
为了达到好的富集效果，一抗是HiCuT实验的关键，建议选择被ChIP及IF实验验证可用且引用文献较多的抗体。
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