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PacBio测序简介

PacBio测序即单分子实时测序,其以SMRT Cell为载体进行测序反应。测序开始时,悬浮在溶液中的样品DNA的环状文库片段涌入SMRT Cell的纳米微流控芯片表面。这种芯片的表面上覆盖着几百万个纳米级直径的小孔,称为零模波导孔(ZMW)。样品流过SMRT测序芯片时,DNA环状文库被固定在ZMW孔的底部。样品DNAZMW捕获后,4种不同荧光标记的dNTP通过布朗运动随机进入检测区域并与库制备过程中附着在样品DNA上的DNA聚合酶结合,开始复制DNA分子。当聚合酶将新的核苷酸碱基合并到新复制的链中时,会释放出微小的光,并被检测器捕获。根据发射的光,测序系统可以确定哪种DNA碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)被合成了,从而得到DNA序列信息。




PacBio Revio


  与传统的二代测序技术相比,三代PacBio测序技术具有超长读长、无需扩增、无GC偏好性、可以直接检测碱基修饰等优点,在科研与医学相关领域得到广泛应用。PacBio最新推出的Revio测序平台只有CCS(Circular Consensus Sequencing,环形一致性序列)测序模式,直接以BAM格式输出HiFi reads


HiFi测序

  在CCS测序模式下,因酶读长(平均90-100 Kb)远大于插入片段长度(10-20 Kb),测序时聚合酶会绕着DNA模板进行滚环测序,使得插入片段被多次测序。这样单次测序中造成的随机测序错误,可以通过算法进行自我纠错校正,最终得到高准确度的HiFi Reads


HiFi测序示意图



  菲沙基因PacBio Revio平台包cell测序,单个cell HiFi产出最高达到110.5 G,平均HiFi产出为98.5 G;平均读长超过16 kbN50超过16.5 kb;平均质量值在Q30以上。菲沙Revio平台各产出指标均达到行业领先水平。具体数据见下表。



1 菲沙Revio平台单个cell产出统计表



3个样本等量混合建库,混测1Revio上机测序。混样原始产出91.21 G,各样本拆分结果接近30 G,数据拆分率为98.68%各样本的数据拆分一致性好,且3个样品的读长与平均质量值cell测序类似。


2 菲沙Revio平台混样产出统计表


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