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大豆共生根瘤菌全基因组甲基化检测

作者:Frasergen浏览次数: 日期:2017年1月6日 14:55

上周给大家介绍了菲沙基因PacBio Sequel的下机数据,无论在基因组方面还是转录组方面的表现都还不错,得到了大家的一致认可。其实PacBio测序除了在读长方面的优势外,还有另外一个重要的优点——直接读取碱基修饰信息。它能够将测序过程中实时监测到的单核苷酸荧光信号与碱基动力学信息相结合,获得每个碱基的修饰信息。鉴于PacBio直接读取碱基修饰的优势,近期发表在《Frontiers in Microbiology》的一篇研究中,来自佛罗里达大学和密苏里大学的研究人员利用PacBio平台对大豆根瘤菌进行了全基因组甲基化研究,揭示了表观遗传学与共生之间的关系。

研究材料

选取自由生活状态(培养)和共生状态(感染)两种生活状态下的的根瘤菌,分别提取基因组DNA。

测序策略

采用PacBio RS II平台,选用P6-C4试剂,提取自由生活状态和共生状态的根瘤菌基因组DNA,直接对提取后的DNA进行测序。两者测序量分别为3个SMRT cell和12个SMRT cell。

测序结果

(1)自由生活状态的根瘤菌:测序258.85X,过滤后得到约2.93Gb的数据,平均读长约13.85Kb,基因组组装后获得的单个contig,大小为9.113Mb;

(2)共生状态的根瘤菌:测序331.12X,平均读长为9.474kb,约32.3﹪的reads可以比对到参考序列上,相似度99.23﹪,其中仅检测到的极少量的大豆基因组污染,约0.39﹪。在组装得到的新基因组中,位于1,000,419bp~1,681,419bp之间发现了一个大小为681kb的共生岛。

五种motif在共生状态下甲基化模式发生改变

研究人员对甲基化的DNA进行motif的鉴定,一共发现5个甲基化motif,分别为CAY(N)6CTC ,GAGA(N)6RTG motifs,GANTC,CRAGGAT和CCTTGAG。比较发现这五种motif在培养状态和共生状态下的甲基化程度各不相同:

(1)CAY(N)6CTC和GAGA(N)6RTG motif:培养状态下这两个motif均发生甲基化,但是在共生情况下甲基化分别下降至86.1%和82.6%,说明细菌在共生过程中甲基化位点共减少了651个;

(2)GANTC motif:共生过程中,该motif甲基化由原来的99.76%减少至97.46%,减少了765个位点;

(3)CRAGGAT motif:培养状态下,4005个CRAGGAT motif中有4003个motif的第六位的A碱基位点发生甲基化,而共生状态下仅87.5%的motif发生该位点甲基化,减少了499个位点;

(4)CCTTGAG motif:仅在共生状态下发生甲基化,第六位的A碱基发生甲基化超过80%。该motif的甲基化发生在1410个基因5‘端上游的非翻译区或编码区,其中116个基因位于共生岛中,398个基因表达显著改变。

 

图1.根瘤菌在自由生活状态和共生状态下全基因组范围内甲基化位点变化的比例

 

全基因组范围差异甲基化

在自由状态和共生状态下,5个DNA motif中共有3276个发生甲基化状态改变。自由状态下GANTC、CRAGGAT、CAY(N)6CTC和GAGA(N)6RTG四个motif的m6A甲基化位点分布位于2号位、6号位、2号位和4号位,其中CRAGGAT motif中还存在少量m4C甲基化,具体motif分布情况见表1。

除了CCTTGAGmotif之外,其余四种motif在自由生活状态的甲基化均高于共生状态,而CCTTGAG motif的甲基化仅在共生状态下出现,在基因组中存在1700个位点中,80%在共生状态下发生甲基化。

表1.自由状态和共生状态的Motif概要

 

共生关系可能受表观遗传学调控

通过基因表达分析发现,在总体水平上,自由生长状态的基因表达量比共生状态的基因表达量显著增多,但是在共生区域,该表达量呈相反趋势。在全基因组范围内有768个基因在共生关系建立的过程中,甲基化状态和基因表达水平会发生显著改变。共生岛区域内的89个基因的甲基化状态和基因表达均发生改变,约有一半的基因可能对共生关系的建立起着非常重要的作用。研究者结合基因表达和甲基化分析发现,在共生岛屿,有9个已知的共生相关基因参与了共生关系建立的过程,包括侵染、根瘤发育和固氮酶的形成过程。研究人员发现随着甲基化的变化共生相关的基因在表达上出现显著的变化,由此推测,表观遗传学(甲基化)可能影响共生关系的建立。该结果为表观遗传学和共生菌后期的研究提供了新的方向。

表2.已知共生相关基因的基因表达和甲基化变化统计

 

参考文献

Davisrichardson A G, Russell J T, Dias R, et al. Corrigendum: Integrating DNA Methylation and Gene Expression Data in the Development of the Soybean-Bradyrhizobium N2-Fixing Symbiosis[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7(361).

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