意见与建议
首页市场动态市场资讯 > CRISPR/Cas9靶向捕获“牵手”PacBio SMRT
详细信息

CRISPR/Cas9靶向捕获“牵手”PacBio SMRT

浏览次数: 日期:2017年9月14日 16:30

全基因组测序和靶向测序已被广泛用于疾病基因组特征和分子机制研究中,靶向测序的常见富集技术有PCR扩增目标区域或基于探针的靶向捕获,但这两种方法都需要PCR扩增,使研究人员无法对原本的基因组区域进行测序,不能保证测序结果的真实性;由于目前大规模使用的二代测序短读长的技术限制,人们对重复序列扩增引起的疾病分子机制研究存在着巨大的挑战。

近期Nature合作期刊Parkinson's Disease发表了由多个学术机构共同完成的一项研究,研究人员首次将无需PCRCRISPR/Cas9靶向捕获技术与同样无需PCRPacBio长读长、单分子实时测序(SMRT)技术完美结合,实现了从单碱基分辨率水平对完整的ATXN10基因重复扩增区域进行测序和分析,揭示出帕金森病与ATXN10基因型和表型之间的关系。

一,研究背景

10型脊髓小脑共济失调(SCA10)是一种异质性的神经退行性疾病,以小脑共济失调为主,常常伴随着多种神经系统症状。现已确定这些疾病是由重复扩增引起的,重复扩增的长度可能对发病年龄、严重程度或疾病发展有较大影响。其中,22号染色体上ATXN10基因中ATTCT五核苷酸的扩增是SCA10的起因。ATTCT的正常重复次数在10~32次之间。若重复次数在280~850,则疾病的外显率较低;若重复次数达到850~4500,则疾病完全外显,准确地鉴定重复次数对于此疾病的诊断非常关键。

共济失调患者脑部核磁共振图像

二,研究家系

 一个来自墨西哥家庭,兄弟姐妹中6人基因组均具有ATXN10重复扩增,但具有不同的临床表型:

(1)四名患者表现出SCA10临床表型,伴随癫痫和渐进性痴呆等临床症状;

(2)一名患者表现出共济失调及早发性左旋多巴反应性帕金森综合征;

(3)一名成员虽携带了大量的ATXN10重复扩增,但并未出现任何临床症状。

三,研究方法

通过CRISPR/Cas9靶向捕获技术获得完整的ATXN10重复扩增序列,然后对富集产物进行PacBio SMRT测序。富集及测序过程如下:

CRISPR/Cas9富集与PacBio SMRT测序的组合原理

四,研究结果

通过对富集得到ATXN10重复扩增序列进行测序,结果表明:

(1)四名SCA10患者ATTCT发生~480次重复,并同时具有~920ATTCC重复干扰序列,该重复干扰序列占总重复扩增区域的60%

(2)共济失调和帕金森临床症状的患者,具有1304次的ATTCT重复,但不带有ATTCC重复序列。作者认为这种ATTCC重复干扰序列可以作为一种遗传修饰因子,并推断该遗传修饰因子的缺乏可能在疾病过程中发挥作用,导致多巴反应性帕金森综合征的临床表型。

3)一名成员携带了~1076次的ATTCT重复序列,但并未出现任何临床症状。作者推测可能是年龄原因,随着时间的推移,该成员后续也可能会出现此类疾病表型。

基于PacBio测序的ATXN10重复扩增序列结构示意图

作者指出:对重复扩增区域进行完整测序,明确致病基因的遗传结构,对于揭示遗传修饰因子与临床表型的关系具有重大意义。我们利用PacBio SMRT单分子测序与CRISPR/Cas9捕获的组合方法成功地鉴定了重复扩增的遗传组成,发现了新的遗传修饰因子,揭示出帕金森病与ATXN10基因型和表型之间的关联,并初步阐明了发生临床表型差异的原因。

CRISPR/Cas9靶向捕获“牵手”PacBio SMRT的这个组合技术很有创意,针对单个靶向位点,特别适用于研究有复杂重复序列的基因。菲沙基因是目前国内唯一一家获得PacBio官方认证的单分子实时测序提供商,我们高质量的数据产出和高水平的生信分析服务,在动植物、微生物、食品工业、人类医学等相关的组学研究中熠熠生辉!欢迎与我们合作!

参考文献:

Birgitt Schüle, et al., Parkinson’s disease associated with pure ATXN10 repeat expansion. npj Parkinson's Disease (2017) 3:27. doi:10.1038/s41531-017-0029-x.

所属类别: 市场资讯

该资讯的关键词为: