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PacBio Sequel全基因组测序的最优流程

作者:frasergen浏览次数: 日期:2017年3月20日 10:40

导读:

PacBio最近的一篇文章 “Best Practices for Whole Genome Sequencing Using theSequel System”中系统推荐了PacBio Sequel在基因组测序和组装中应用的最优流程,包括如何利用Sequel最新试剂构建长片段文库(>30kb),如何使用微量(5ug)基因组DNA使每个文库的产出最大化,提升Sequel系统在动植物基因组测序应用能力。

背景:

动植物基因组测序因其基因组大、高重复序列和杂合度而备受挑战,Sequel系统具有长读长、准确一致性和均匀的覆盖度使其在大基因组、复杂基因组组装时得到更加完整、准确和连续的序列。最新的Sequel试剂可以产出5~8G/SMRT cell,且每cell文库消耗可低至5pM,照常可以得到平均长度为10~15kb的长读长序列,最长可达60kb,50%的可用序列在20kb以上。

Sequel系统已经趋于稳定,过去的半年销量大幅增长,因其通量较高导致三代测序成本降低,将会逐渐取代PacBio RSII在基因组测序市场中的应用,预计在不久的将来会大量应用于大或复杂动植物基因组de novo测序组装。

大片段文库构建工作流程

构建大片段文库需要满足以下条件:

1.高质量DNA;

2.脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行质控;

3.设置最优的打断参数;

4.最佳片段筛选;

5.DNA损伤修复;

6.依据推荐值上样;

图1.大片段插入文库构建流程

样本QC推荐

 

通过PFGE检测可以获得样本质量和片段大小信息,PacBio官方建议使用Bio-Rad的CHEF Mapper (图2A)或Sage Science Pippin Pulse (图2B)仪器进行电泳检测。 

图2.PFGE仪器图示(A、B)和CHEF检测图例(C)

如图2C中显示,Lane 3显示高质量的DNA分子电泳检测大小在150kb左右,可以打断到需要的片段大小(>30kb),Lane 4显示降解后的DNA,根据降解程度,该样品无法构建30kb大片段文库。

文库构建推荐

Covaris的g-TUBE设备无法将基因组DNA打断成>30kb的片段,因此,官方推荐使用Megaruptor(图3),该仪器操作简单、全自动和高重复,基因组DNA打断片段可达75kb。

图3.PacBio推荐的大片段打断仪器—Megaruptor

利用Megaruptor对人类基因组DNA进行打断,分别打断为10、20、30、40、50、60和75kb的片段,剪切到30、40、50kb的片段进行构建>30kb的文库最佳(图4)。

图4、利用Megaruptor仪器打断人类基因组DNA

DNA打断步骤推荐:1. 利用PFGE评估gDNA分子质量,2. 少量样本评估打断实验确定最优打断条件,3.大量DNA样本打断。完成片段筛选后的DNA需要进行损伤修复,可以提高读长。

DNA的需求量依据项目方案,包括基因组大小、覆盖度及基因组复杂度,可以以表1的文库产出作为参考。

表1、SMRTbell文库得率

对于上样量推荐,使用Sequel 2.0试剂和升级的仪器工作流程(Instrument Control Software 4.0),可以显著降低SMRTbell文库的上样量需求,该系统产生的read平均长度10~15kb,5~8Gb/SMRT cell,而上样需求量较PacBio RSII低(表2)。

表2、PacBio sequel和RSII上样量比较

数据分析

利用HGAP或FALCON进行纯三代数据de novo组装,对于Hierarchical基因组,利用HGAP组装(图5);而diploid-aware基因组组装中,使用FALCON(图6),主要应用于杂合非近亲杂交的基因组。

利用以上最优流程进行某植物测序,相关结果见图7。可以看到组装质量依然达到白金级参考基因组,Contig N50达到1.2Mb。

图5、HGAP组装示意图

图6、FALCON组装示意图

图7、某植物利用PacBio sequel测序数据

总结

PacBio Sequel在基因组测序已趋稳定,平均读长10~15kb,产出5~8Gb/SMRT cell;建库过程中,利用PFGE检测可以评估gDNA、剪切的DNA、SMRTbell 文库及大小筛选后的SMRTbell文库,利用Megaruptor system剪切DNA产生>30kb的DNA,该过程中优化剪切条件后进行大批量剪切实验,size-selected DNA损伤修复后进行上机测序,de novo拼接使用HGAP或FALCON算法。

 

 

参考文献 

Nick Sisneros, Shreyasee Chakraborty, et al., Best Practices for Whole Genome Sequencing Using theSequel System.

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