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哺乳动物体内甲基化“新星”6mA

浏览次数: 日期:2016年4月15日 15:12

DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传调控,在哺乳动物生命活动多个方面发挥着作用,例如基因印迹、X染色体失活、肿瘤发生等,但是已有研究表明在哺乳动物体内的甲基化修饰主要是5mC,不存在其他类型的甲基化修饰,而其他的例如6mA这种甲基化修饰主要存在于原核生物和少数真核生物中。随着研究技术的不断发展,研究人员陆续在线虫、果蝇和衣藻基因组中发现了6mA修饰,但仍然无法确认哺乳动物体内是否存在这种修饰。直到近期Nature上发表的一篇文章终于证明了哺乳动物体内6mA的存在,作者利用PACBIOSMRT测序技术揭示了小鼠胚胎干细胞中存在的6mA甲基化修饰并研究了相关活性功能,接下来让小编为大家一步步介绍哺乳动物体内的6mA是如何被发现的。

1、高精度CCS序列测定H2A.X结合的DNA序列

H2A.XsDNA出现断裂时替代H2A的变体,对DNA修复具有重要作用。与H2A.X结合的DNA序列在细胞周期中具有重要作用。作者用ChIP技术富集该区域的DNA片段,然后利用PACBIO三代测序对富集DNA片段进行测序,测序中无PCR扩增。ChIP富集得到的DNA片段长度介于200bp~1000bp,而三代测序的平均读长为10kb~15kb,能够完全覆盖并测序这些DNA片段,产生高精度和高覆盖度的CCS序列(Circular Consensus Sequence,环形一致序列)。通过这种SMRT-ChIP技术,作者检测到1,1086mA甲基化位点,每个位点的测序覆盖度至少为25×。

2、高效液相色谱法(HPLC)验证6mA甲基化位点

利用质谱法验证,确认小鼠胚胎干细胞(ES cell)中存在6mA甲基化修饰,LC-MS/MS分析了合成链和ES细胞中甲基化修饰, ESIQTOF-MS/MS图谱分析了标准的6mA核苷成分和ES细胞中6mA组分,结果均确认了SMRT-ChIP技术测序检测到的6mA,同时利用质谱法还能够区分1mA6mA,进一步排除了SMRT检测由于信号误差导致的假阳性结果。

3Alkbh16mA去甲基化酶

DNA去甲基化是细胞生命周期中一个重要过程,它调控了基因复制和基因表达过程。通常新DNA合成和基因印迹过程中会出现DNA去甲基化。在哺乳动物体内既然检测到了6mA甲基化修饰,那么用于作用于6mA的去甲基化酶是什么呢?已有研究证明Alkbh2Alkbh3可以有效作用于1mA3mC起到脱甲基作用,但是对6mA却无作用。于是研究人员选取了该家族中另一个在胚胎早期发育中具有重要作用的Alkbh1。实验结果,在小鼠体内敲除Alkbh1基因后,H2A.X区的DNA序列中N6mA含量增加3~4倍。

46mA抑制基因表达

为了研究6mA在基因组中起到的作用,研究人员采用RNAseq对敲除的ES细胞进行转录组测序分析。结果显示550个基因表达下调,大部分下调基因为发育因子或种系特异性基因,并且这些下调基因明显集中于X染色体上。实验结果说明ES细胞中6mA增多会导致基因沉默,6mA抑制了基因表达,这与之前再其他物种中发现的6mA作用完全不同,已有研究的线虫、果蝇和衣藻中6mA会激活基因表达。

 

56mA集中分布于LINE-1

鉴于ES细胞中6mA的抑制作用不同于以往其他物种中的发现,研究人员利用N6-mADIP-seq研究了Alkbh1基因敲除的ES细胞中6mA的差异甲基化区域(DMR)。结果显示检测到的6mA信号集中分布在基因间区域,进一步研究显示6mA甲基化主要分布在LINE,尤其是全长L1元件上。同时,研究还发现6mAL1上的分布与其进化年龄相关,主要分布于较为年轻的L1young full-length L1 elements)上,进而下调其表达量。

小编手记:

近年来,研究人员在无脊椎动物和脊椎动物体内揭示了越来越多的新发现,然而我们目前所掌握的知识显然只是这海量基因组信息的冰山一角。如何进一步去挖掘更多有价值的信息一直是科研工作者致力于推进的工作。随着科学技术的发展,我们拥有了更多可以利用的新型科技手段,其中PACBIO SMRT测序就是代表性的第三代基因测序技术,该技术的出现帮助我们揭秘了大量物种的基因组信息,带来了令人振奋的结果。去年Cell上发表的文章中利用PACBIO SMRT测序首次证明了线虫体内的6mA甲基化修饰(Greer EL et al., Cell, 2015),今年则在Nature上发表了这篇利用PACBIO SMRT证明哺乳动物体内的6mA甲基化修饰,说明这种先进的三代测序已经开始在表观遗传学研究领域发挥重要作用。除此之外,利用PACBIO三代测序还能帮助研究人员更好的进行基因组测序、全长转录组测序以及全基因组范围不同类型甲基化修饰和其他碱基修饰分析。最后小编开始思考一个问题,在本文中研究人员首次在哺乳动物中证明了6mA和并研究了对应的去甲基化酶,那么下一次利用PACBIO SMRT测序揭示的物种体内表观遗传新发现又会是什么呢?

 

参考文献

WuT P, Wang T, Seetin M G, et al. DNA methylation on N6-adenine in mammalianembryonic stem cells[J]. Nature, 2016.

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