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端午献礼:菲沙“全长16S/18S/ITS扩增子测序”新产品

浏览次数: 日期:2016年6月8日 14:53

16S/18S/ITS基因扩增子测序是环境微生物群落多样性分析的重要手段之一,通过PCR扩增和测序得到大量变异位点信息,从而对环境微生物多样性及群落组成差异进行分析。

二代测序的局限性

在过去的研究中,16S/18S/ITS基因扩增子测序一般基于Illumina HiSeq 2500 和Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台。二代测序片段长度在300-600 bp,可以覆盖16S V4区、18S V9区,但是对于全长区域却无能为力。而微生物基因突变位点并不是均匀分布的,高估或低估这些突变都将影响微生物群落的分类,因此二代扩增子往往无法反映微生物群落的真实情况[1]

菲沙全长6S/18S/ITS扩增长测序

菲沙基因针对二代扩增子的局限性,开发了全长16S/18S/ITS扩增子测序实验和分析流程。一般来说,原核微生物的16S rRNA基因长度约为1500 bp,真核微生物18S rRNA基因长度1500-2000 bp,而ITS区长度则为400-900 bp。PacBio SMRT测序拥有二代测序平台无法比拟的超长读长,可以完全覆盖16S/18S/ITS基因区,为微生物群落分类鉴定提供更加准确的依据。

 

实验流程

 

 

信息分析内容

· 标准分析

1、原始数据质控

2、物种组成分析

     2.1 OTU聚类

     2.2 OTU比较分析

     2.3 物种注释

     2.4 物种丰度聚类

3、样品群落多样性(Alpha Diversity)分析

     3.1 稀释曲线(Rarefaction Curve)

     3.2 香农指数曲线(Shannon Indices)

     3.3 α指数(Alpha Indices)分析

     3.4 秩-丰度曲线(Rank Abundance Curve)

4、多样品差异比较分析(Beta Diversity)

     4.1 主成分分析 (PCA)

     4.2 主坐标分析(PCoA)

     4.3 β指数(Beta Indices)分析

     4.4  LEfSe分析

     4.5 组间物种差异分析

· 高级分析

1、组间群落结构差异分析

2 、度量多维尺度分析

3、环境因子分析

4、经典案例解析

PacBio SMRT 测序与罗氏454测序在16S rDNA研究中的结果比较[2]

1、研究方法

分别用PacBio RSII platform与罗氏454测序平台对纯培养物Shewanella oneidensis MR1进行全长(V1-V9)测序和短片段(V1-V4)测序,然后分别按照97%和99%的序列一致性与NCBI数据库进行比对,得到属和种水平的注释信息;

2、研究结果

比较用454、PacBio(XL/C2) 和PacBio (P4/C2)三种测序方法得到的结果,发现用PacBio (P4/C2)测序得到在属和种水平上的注释结果,相比PacBio (XL/C2)而言,准确性从80%提高到了大于99%;而454测序由于序列较短(~500bp),只能在属水平达到较高的准确性。 

参考文献

1. Singer E, Bushnell B,Coleman-Derr D, et al. High-resolution phylogenetic microbial communityprofiling[J]. Isme Journal, 2016.

2. Mosher J J,Bowman B, Bernberg E L, et al. Improved performance of the PacBio SMRTtechnology for 16S rDNA sequencing[J]. Journal of Microbiological Methods,2014, 104:59-60. 

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