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癌症基因检测,液体活检能取代组织活检?

作者:Frasergen日期:2017年1月20日 10:33

摘要:

2015年,液体活检技术被MIT Technology Review杂志评为年度十大突破技术之一。液体活检是指通过血液或者尿液等体液对癌症等疾病做出诊断,ctDNA(circulating tumor DNA , 循环肿瘤DNA)作为液体活检癌症诊断的生物标志物之一,受到越来越多的关注。有研究表明:非侵入式液体活检对检测晚期肺癌患者的基因突变及治疗更加有效,取代具有黄金标准的组织活检将指日可待。这项研究数据是来自美国宾夕法尼亚大学Abramson Cancer Center的研究者在《Clinical Cancer Research》上发表的。研究同时发现,非侵入性液体活检为癌症患者治疗状态的实时连续分子监测等临床应用提供了很好的帮助。  

背景介绍:   

非小细胞肺癌(non–small cell lung cancer,NSCLC)约占所有肺癌的80%,多种基因突变已被证实与NSCLC的发生、治疗、耐药相关。 EGFR 敏感性突变(Exon 19 deletions; Exon 21 L858R)的存在可能对第一代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)有效果,但是许多患者在治疗后的12到24个月会产生耐药。对EGFR–TKI耐药分子机制的精确识别有着重要的临床意义,对于含有特定EGFR和ALK 耐药性突变的肿瘤,可以采用第二代以及第三代TKIs。

肿瘤组织是突变分析的优选样本来源,《NCCN指南》推荐重复组织活检来确定那些经过一线靶向治疗后癌症有进展的患者体内的耐药发生机制。然而,对于一些患者,组织样本较难获取,而且有些组织样本不能够反映出真正潜在的肿瘤内与肿瘤间的遗传异质性。ctDNA是凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到血液中的、短的、双链DNA片段。它可以在晚期非小细胞肺癌患者体内被检测到。ctDNA的靶向高通量测序能够在单个平台上广泛的分析遗传变异情况。本研究以NSCLC患者的血液及组织为样本,使用NGS (Next Generation Sequencing)平台,检测那些具有临床意义的基因突变情况,评估将ctDNA NGS检测作为组织活检的补充或者二选其一方法的可行性。

患者入组情况

从2015年2月到2016年3月,登记入组102名,在宾夕法尼亚大学Abramson癌症中心治疗的患者,其中100名被诊断为NSCLC,其余两名未知癌症种类。他们接受ctDNA检测的目的大部分为检测靶向基因突变,包括52名患者(n=52);还有检测耐药性突变(n=36)、在那些有疾病进展的患者中确定可对应临床措施的突变(n=12)、追踪已在组织样本中获得的突变来监测治疗后的反应(n=2)。

102名连续性入组的患者,共获得112份血液样本,进行 ctDNA NGS分析,组织样本的NGS只在50名患者((49.0%))中完成,如下图:

图1. 样本情况概览

血液样本的ctDNA提取及测序  

从血浆中提取循环游离DNA(cfDNA; cell-free DNA),运用Illumina Hi-Seq 2500的双端合成测序平台进行cfDNA测序。cfDNA中体细胞突变的检测是用来证实ctDNA的存在。所使用的70个基因Guardant 360 panel包含30个基因的全外显子以及40个额外基因的关键外显子区域,总共146,000bp(146 KB)的靶向区域,平均覆盖深度10,000x。

肿瘤组织DNA(tDNA; tumor DNA)测序

所有的组织样本中,38名患者的样本运用Illumina TruSeq Amplicon –Cancer Panel覆盖47个基因的热点或者外显子区域的序列。剩下的12个患者,因DNA量不够测47个基因,于是另用含20个基因的Penn Precision Panel,运用Illumina MiSeq 进行测序。

统计分析及ctDNA和tDNA的一致性分析

应用Integrative Genome Viewer比较组织和血液样本的测序数据,覆盖两种样本的变异数据包含于一致性分析中。运用Stata v 14 (StataCorp)进行统计学分析。

结果

1、ctDNA中有临床意义的靶向驱动与耐药基因突变检测

在102名患者中,有86名(84.3%) 患者的ctDNA中共检测到275个变异位点,包括SNVs, indels, 和fusions,剩余的16名患者中,得到了足量的cfDNA,但测序后却没有发现体细胞变异,也就是没有ctDNA。在45个基因中检测到变异,其中EGFR的突变最普遍,占了全部变异位点的20%。(图2) 在驱动基因突变中(有对应FDA批准的治疗药物),EGFR的19外显子缺失比21外显子的L858R突变更常见,分别在16名(15.7%)及10名(9.8%) 患者中出现。 EML4–ALK融合对crizotinib敏感,该突变也在两名患者中被检测到。

图2 . ctDNA中检测到的突变情况

为了理解ctDNA NGS检测所能对应的临床应用措施,所有检测到的变异位点都交叉参考FDA批准的药物、超说明书(off-label)药物或者是正在进行临床研究的治疗方法。患者中的大多数(70%)都确定有相关的临床实验可进入,56名患者(55%)有可潜在应用的超说明书靶向治疗药物,32名患者(31%)可采用对应其突变的FDA批准的药物。综合考虑,这些数据表明非小细胞肺癌患者的ctDNA分析产生的结果,可高度匹配相关的临床治疗方法。

表1. 突变相关的治疗药物与临床试验列表

2、ctDNA和tDNA测序结果的比较

再来比较50名患者,他们均进行了tDNA 和ctDNA的NGS检测。其中,在tDNA 中,39名患者(78%)中检测到≥1处突变,在ctDNA中,42名患者(84%)检测到≥1处突变。相比tDNA panels而言,ctDNA检测基因覆盖的范围更广,每个患者在ctDNA中检测到的平均变异数为2.8,tDNA中为1.5。当仅考虑两种panels均覆盖的变异位点 ,不同之处可分别缩小至55 和67个变异位点,有41个位点则是两者都可检测到的,两种情况下的所有变异覆盖及检测一致性为60%。

图3 .ctDNA和tDNA中检测到的所有变异位点

在50名tDNA和ctDNA均检测的患者中,有24个治疗靶向性驱动基因EGFR突变在tDNA中被检测到,19个的在ctDNA样本中检测到,整体一致性达到79%。EGFR T790M耐药性突变在4个tDNA样本(8%)及8个ctDNA样本(16%)中被检测到。考虑到组织及血液样本的收集时间间隔跨度从0天到大于两年间,当血浆和组织样本的收集时间间隔拉长,研究者试图探究肿瘤的遗传进化是否随着时间和治疗压力而导致一致性的降低。研究者计算tDNA和ctDNA中都检测EGFR突变的一致性,两种样本的收集时间间隔分别为≤2 周, ≤2个月, ≤6个月以及>6个月,结果发现一致性分别为100%, 92%, 94%以及60%,这很明显是与两种样本的收集时间间隔是相关联的(P= 0.038)。

图4 . ctDNA和tDNA样本收集时间间隔与检测到的突变一致性关系

3、ctDNA中分子异质性的预后应用

由于分子异质性也是与患者不良的结果相关联,本研究也评估了ctDNA分子异质性的预后意义。对于处于癌症转移阶段的98名患者,在那些血浆中检测到≥3个变异位点的病人中,从癌症转移被诊断开始算起的中位生存期是46个月,相比而言,<3个变异位点的则是62个月,虽然结果尚未达到统计学意义。研究者也发现cfDNA的水平是与患者的不良结果相关联的,从血浆中提取的总cfDNA的平均浓度,在本研究过程中逝去的患者的明显高于仍生存的患者(4.0 vs. 1.6 ng/uL; P < 0.001),更高的cfDNA浓度与不断减少的总生存期是明显相关的(从癌症转移被诊断开始算起),cfDNA浓度≥3 ng/uL与24个月中位生存期(对比于46个月)相关联的(P < 0.01)。

  图5.血浆中ctDNA检测到的变异位点数(A), 及cfDNA的浓度(B)对患者生存情况的预测

4、治疗中患者状态的实时连续分子监测

作为一种非侵入性检测方式 ,ctDNA NGS相比于组织样本的NGS,能够更频繁的实现,所以为疾病的分子监测的连续检测提供了可能性。本研究也进行了6名患者的连续的ctDNA检测,作为疾病监测的一部分。其中有3名患者,未检测到靶向突变。还有3名患者,在治疗过程中, ctDNA中检测到临床上的靶向突变。

图6 . ctDNA的连续检测来进行实时分子监测评估治疗过程中药物对患者的疗效

讨论

1、本研究说明了运用comprehensive gene panel的高通量测序(NGS)在晚期NSCLC患者中进行疾病管理的可行性。随着靶向药物的数量持续增长,对驱动及耐药基因突变的检测在临床上也变得越来越重要。一线TKIs的治疗,需要先确认相应的基因突变,如EGFR 21号外显子的L858R或者19号外显子的缺失,这些都可以通过组织样本的的检测来获得结果。然而,对靶向治疗的监测或者确认耐药性基因突变,这些通过重复组织活检难以做到。而基于血浆的ctDNA检测是一种非侵入性方法,能够对患者进行实时分子监测,没有侵入性活检的风险。对于NSCLC患者,液体活检能够确认耐药性基因突变,从而使患者采用二线或者三线TKIs,或者当无靶向突变时采用化疗用药。同时,液体活检也可能检测得到在初级组织或者是开始的活检中不存在或尚未发现的突变。

2、本文展示了在一项登记入组102个肺癌病人的研究中,运用一个包含70个基因的的ctDNA NGS  panel ,来检测临床上可对应治疗措施的基因变异。相匹配的组织测序只有在少于一半的病人中成功进行,主要是由于肿瘤组织的难以获取或者测序所需的DNA量的不足。

3、研究所得到的数据证实了对于进行个体化医疗的晚期NSCLC患者来说,以血液为基础的液体活检的的可行性及临床实用性。总而言之,本研究表现出在晚期肺癌患者及其他临床恶性肿瘤中ctDNA检测用于实时分子监测的良好前景,但仍需要更深入的研究,来进一步评估转移性疾病的演化及非侵入性方法的临床有效性。

参考文献:

Thompson J C, Yee S S, Troxel A B, et al. Detection of therapeutically targetable driver and resistance mutations in lung cancer patients by next generation sequencing of cell-free circulating tumor DNA.[J].Clinical Cancer Research, 2016.

 

                         

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