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为什么克隆动物未曾普及

作者:frasergen日期:2016年12月23日 09:31

摘要

早在20年前,英国科学家伊恩·维尔穆特博士通过细胞核移植技术将成年哺乳动物羊的体细胞成功克隆出了一只小羊——多莉。1997年2月27日的英国《Nature》杂志报道了一项震惊世界的研究成果,继多莉出现后,“克隆”这个术语变得广为人知。克隆猪、克隆猴、克隆牛……纷纷问世,似乎一夜之间,克隆时代已来到人们眼前。但是为什么克隆人迟迟没有现身?近期,来自美国和法国的研究人员在《PNAS》杂志上发表了一项研究成果,为我们揭示了克隆哺乳动物面临的诸多挑战,跟着小菲的步伐,我们来一探究竟。

材料选取

研究人员以哺乳动物牛为研究对象,选取细胞核移植发育18天以及34天克隆牛胚胎组织和相应的子宫内膜组织(包括内膜增生组织和非增生组织),分别提取总RNA。选取人工授精的孕体作为对照组。

图1.样本收集代表图

测序策略与测序结果

采用Illumina HiSeq 2000 测序平台,构建100bp的文库,进行转录组测序。对87个样本进行二代测序,平均每个样本测序量约6Gb,共注释1.3万多个基因。

细胞核移植孕体的损伤来自于胚胎外组织

研究人员在孕育18天和34天的人工授精胚胎外组织中检测到1万多个表达基因,其中大多数基因(9492个)在胚胎外组织中均有表达。并且34天的两个胚胎外组织中基因表达情况极为相似,18天时两种胚胎外组织中基因表达仅略有不同。与之相比,研究人员在18天的细胞核移植的胚胎外组织中鉴定出5000多个(约50%)与核移植相关的差异表达的基因,但是在34天的组织中只检测到0.4%-2.1%的差异表达基因,这种显著的差异表明,在细胞核移植孕体中,大量的异常调节基因来自植入前胚胎外组织。

胚胎外组织中存在大量与胚胎致死相关基因

为了进一步了解细胞核移植孕体死亡的可能性机制,研究者查询了小鼠基因组信息学敲除数据库,与小鼠基因组信息学敲除数据库进行对比后,研究者们在孕期18天胚外组织中发现了123个与胚胎组织形态异常相关的差异表达基因,有121个与胚胎致死有关,有14个与异常胚胎植入有关。该结果表明,细胞核移植孕体植入前期的损伤,可能由于许多胚胎外组织的关键发育基因异常调节导致。研究人员通过基因网络分析发现,细胞核移植孕期18天的胚胎外组织中有许多编码网络调控蛋白的基因下调,但是在34天中,只有4个下调基因,在孕期18天和34天有很少的差异基因重叠,该结果再次说明细胞核移植孕体的损伤由于胚胎外组织的异常调节导致。

表1.胚胎外组织(EETs)中基因表达和差异表达基因

子宫内膜非增生组织是克隆受体主要应答组织

研究人员在孕育18天和34天的人工授精子宫内膜组织(包括增生组织和非增生组织)中检测到1.2万多个蛋白编码基因,在18天的子宫内膜中增生组织和非增生组织间存在显著基因表达差异,而在34天样本中未出现明显异常。研究人员通过细胞核移植与人工授精差异基因的比较发现,18天的增生组织,18天的非增生组织和34天的增生组织有低于1%的基因存在差异表达,但是在34天的非增生组织中有约37%的基因存在差异表达。在34天的增生组织中有大量与激素活性、受体结合相关差异基因的富集,但是在34天的非增生组织中没有明显的富集。这些结果表示子宫内膜可以区分克隆受体,并且非增生组织是主要的应答组织。

表2.子宫内膜组织中基因表达概要和差异表达基因

图2.EET围植入期基因表达

克隆胚胎影响胚胎着床调节系统

通过网络分析,研究人员在细胞核移植孕期18天胚胎外组织中发现,4个干扰素家族旁系同源基因下调。在子宫内膜组织孕期18天中有两个干扰素受体表达,发现8个差异表达基因,3个干扰素受体基因下调。这是妊娠识别的主要信号。该结果表明在子宫中的克隆胚胎影响关键的调节系统,包括促进胚胎着床的信号调节。说明克隆胚胎似乎也对怀孕母牛的基因表达产生了影响。在34天时,一些子宫组织表现出非常不同的基因表达,这可能会影响胎盘。

图3. EET和子宫内膜配基-受体相互作用异常调节基因网络模式

克隆失败的原因原来是它

研究者选取7个与胚胎植入过程相关的基因,利用定量PCR对RNA-seq结果进行验证,其中5个基因在孕期18天时与IFNT(干扰素)信号下调相关,2个基因在孕期34天时与上调基因相关,验证结果与RNA-seq的结果一致。由此表明,哺乳动物克隆胚胎存活率低的原因是由胚胎外组织大量基因异常表达引起。

 

 

参考文献

Biase FH, Rabel C, Guillomot M, et al. Massive dysregulation of genes involved in cell signaling and placental development in cloned cattle conceptus and maternal endometrium.[J]. PNAS, 2016.

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