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您还在为高质量基因组DNA的提取而烦恼吗?

日期:2016年12月16日 09:43

前言:

将复杂基因序列组装成高质量的参考基因组是各位科研人员面临的强大挑战,二代测序的短片段序列(约300bp)已经不能满足这个要求,三代长片段(大于10K)对复杂基因组组装效果有较大的提升,但是获得较高质量的基因组DNA才是进行三代测序的第一步。目前,用一些传统的方法获取的DNA片段较短,并不能满足三代测序的要求;能满足这种要求的DNA提取方法(如BAC文库)即耗时又费钱。小菲今天给大家介绍一种成本低、周期短的高质量基因组DNA提取方法,绝对的干货哦。

实验材料:

选取生长三周的向日葵幼苗叶片,迅速放入液氮中冷冻并保存于-80℃中,防止DNA的降解。

实验方法:

(1)DNA提取纯化:在液氮环境中将叶片研磨成粉末,使其均匀的溶解在Lysis中,加入SDS缓冲液溶解细胞膜,同时使蛋白质和核酸内切酶失活。再向Lysis中加入RNase A 除去RNA。该过程中一定要迅速均匀的将粉末组织溶解在Lysis中,这关系到DNA提取的产量和纯度。最后向溶液中加入乙酸钾使蛋白质和多糖形成沉淀再通过离心的方法除掉蛋白质和多糖。

(2)磁珠吸附:初步纯化后的溶液用羧酸盐磁珠进行DNA吸附,该方法可有效降低DNA的断裂。

(3)洗脱:DNA吸附于磁珠上后,用70﹪的酒精除掉残留的试剂污染物,再用洗脱缓冲液将DNA从磁珠上洗脱下来。最后用分光光度计对DNA的纯度进行检测。

实验流程

实验结果:

分光光度计检测的结果显示A260/280的值大于1.8,说明基因组DNA中无蛋白质的污染,结合分光光度计其他指标的检测结果均说明该方法获得的基因组DNA纯度较高(详见表1)。该实验中每90mg的向日葵新鲜叶片可提取6.7-7.8ug高纯度gDNA。为了评估提取基因组DNA的完整性,研究者用琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测(图1),结果显示DNA分子的长度大约在20kb-130kb之间。该方法应用在细菌和人的基因组DNA提取中,得到了相似的结果。此外,研究人员将该实验结果与Genomic Tips 20/G commercial 试剂盒提取基因组DNA的结果进行比较,发现两种方法获得的基因组DNA在纯度和完整性上非常相似,但是Genomic Tips 20/G commercial试剂盒在价格上要贵出35倍,在时间上也多出2小时。

表1.基因组DNA的质量和总量

 

图1.基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳

结果验证

为了进一步验证本实验方法提取的基因组DNA是否满足三代测序要求,研究人员使用PacBio RS II平台进行验证。利用本实验方法提取的基因组DNA构建4个不同大小(12-20kb)的PacBio文库进行测序,结果显示,测序长度约15kb,与PacBio标准读长一致,充分证明了该方法提取基因组DNA的纯度和质量能够满足三代测序的要求。

表2.向日葵叶片中不同大小文库的PacBio测序结果

 

参考文献

Mayjonade B, Gouzy J, Donnadieu C, et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules.[J]. Biotechniques, 2016, 61(4).

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