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PacBio测序揭秘“臭虫”线粒体转录组信息

日期:2016年11月10日 08:49

“臭虫”,学名为黄斑椿象(Erthesina fulloThunberg),属于半翅目蝽科的一种昆虫,在我们日常生活中非常常见。2016年2月发表在NC的一篇文章中对臭虫中的另一种“温带臭虫”(Cimex lectularius)进行基因组测序(~650M)并研究了其抗逆相关基因,但关于臭虫线粒体的信息却很少。近期,南开大学的研究人员首次利用三代测序技术对“臭虫”线粒体进行了全长转录组测序研究,构建了昆虫线粒体基因组的第一个定量转录图谱。

一、样本选择

研究者选取一只成年雄性和雌性黄斑椿象除去腹部后的组织(包括触须、目下、翅膀、腿和胸肌),提取总RNA;选取一只成年雄性黄斑椿象,选取一边的腿部组织5mg,将线粒体分离出来并提取线粒体DNA 。

二、测序策略

1、利用三代PacBio RS II 测序平台进行全长转录组测序,选用P6C4试剂,构建一个1~2kb的文库,共测序7个SMRT Cell;

2、利用二代Ion Torrent PGM平台对线粒体基因组进行测序。

三、研究结果
1、测序结果

利用PacBio测序平台对黄斑椿象total RNA进行测序,平均读长为16,262bp,有效数据量大于6Gb。同时,研究人员还利用Ion Torrent PGM平台对黄斑椿象线粒体基因组进行测序,得到约28Mb数据,组装后再结合三代转录组数据进行校正,最终得到线粒体基因组大小约16kb。

2、分析结果

(1)三代测序共得到247,535条转录本序列,因为黄斑椿象线粒体基因不含内含子,其中至少有37.65%的转录本可连续比对到黄斑椿象线粒体基因组中。这个高比对率表明,虽然线粒体基因组中仅含有少量基因,但是该昆虫中大部分的基因表达都源自线粒体基因组。

(2)通过转录本序列与黄斑椿象线粒体基因组比对分析,研究人员得到11个mRNA和2个rRNA(16s和12s)的全长序列,并且每条序列都至少有10条CCS支持,最终构建出第一个定量的昆虫线粒体基因组转录图谱。

图1. 线粒体基因组定量转录图谱

(3)全长转录组数据显示,成熟的mRNA 和rRNA的转录本3’端具有相同的多聚腺苷酸结构。除此之外,一些成熟的mRNA和rRNA转录本含有m7G帽子,这表明线粒体mRNA和rRNA可能具有相同的起源;

图2. 线粒体中mRNAs和rRNAs 的转录结构

(4)多顺反子通常存在于原核生物中,极少存在于真核生物。2015年利用PacBio测序首次报道了真菌中存在多顺反子转录本序列。本研究中,研究人员利用PacBio测序同样在黄斑椿象线粒体基因组中发现了两种类型的多顺反子转录本:第一种类型为两个以上mRNA,中间存在tRNA,第二种类型为多个相邻的tRNA后至多接一个mRNA。

图3.“tRNA符号”的模式

此外,研究人员还在线粒体基因组中发现了少量天然反义转录本(NATs)以及12S rRNA的3种isoform。其中NATs可作为已知的线粒体mRNA或rRNA转录本的反向互补序列,到目前为止NATs已经被证实存在于人类、酵母、小鼠和拟南芥等真核生物中,但在原核生物中仅为预测。

小编手记

本文利用PacBio三代测序技术对黄斑椿象的线粒体进行转录组测序,构建出了第一个动物线粒体基因组的定量转录图谱,获得了该昆虫的全长转录组序列信息。通过与线粒体基因组序列的比对进一步发现,在检测到的全长转录组序列中,线粒体基因组基因表达的转录本高达37.65%,这也是该现象首次被报道。这表明,利用三代测序我们可以获得更加高质量的转录本序列,解决由于转录本序列拼接导致的重要信息(例如3’或5’端信息)丢失问题。2013年,PacBio测序首次被用于小蓝雪花(P. micrantha)叶绿体基因组组装,随后该技术被越来越多的应用于细胞器基因组、转录组的测序,包括甜菜的叶绿体基因组、HIV病毒的线粒体基因组等,借助于PacBio的读长优势,研究人员能够更加轻松的解决细胞器等小基因组的基因组组装、全长转录组测定问题。

 

参考文献

[1] Gao S, Ren Y, Sun Y, et al. PacBio full-length transcriptome profiling of insect mitochondrial gene expression[J]. RNA biology, 2016, 13(9): 820-825.

[2] Gordon S P, Tseng E, Salamov A, et al. Widespread polycistronic transcripts in fungi revealed by single-molecule mRNA sequencing[J]. PloS one, 2015, 10(7): e0132628.

 

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