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第三代测序技术简介

第三代基因测序技术简介

近年来,以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐兴起。 PacBio三代测序又称作SMRTSingle Molecule, Real-Time)测序,即单分子实时测序,该方法基于纳米小孔的单分子读取技术,无需扩增即可快速完成序列读取。Pacific Biosciences2013年成功推出商业化的三代测序仪PacBio RSII后,三代测序开始被广泛应用于基因组研究中。经过不断的改良和升级,PacBio公司在201510月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统,其具有的长读长、高通量、高准确率等特点定将为研究领域带来全新的三代测序体验。

菲沙基因顺应时代潮流,积极研发了针对PacBio三代测序技术的分析工具VariationBlast。同时根据项目需求,不断开发和完善基因组、转录组、宏基因组等方面的算法流程,将协助您完成三代测序数据的处理和分析工作。

PacBio三代测序

1SMRT测序

Single Molecule,Real-Time sequencing,即单分子实时测序,我们简称为SMRT测序,是美国太平洋生物科学公司(PacBio)推出的一项专利技术。顾名思义,SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序,并且实时监控测序结果。

2SMRT Cell

SMRT CellPacBio测序中用于DNA上样的芯片,样本完成建库后装载到Cell中才能进行上机测序。这就等同于二代测序中常常提到的“lane”。一次运行中,我们按照实验需求选择1~16Cell进行测序。PacBio RSII系统配套的一个SMRT Cell的数据产量为500M~1G,最新升级的Sequel系统配套的一个SMRT Cell可产生5~10G的数据,通量大大提升。

3ZMW

ZMWZero-Mode Waveguides)孔,即零模波导孔。每一个SMRT Cell中含有大量这种圆形纳米小孔,直径为50~100nm,该小孔利用了一种物理效应零模波导,外径比激发光波长小,当DNA分子进入小孔后,因激发光从孔底发出的光不能穿透小孔进入上方的溶液区,仅被限制在底部一个足以覆盖被检测DNA部分的区域,进而收集该区域的信号,将背景噪音降到最低。PacBio RSII使用的一个SMRT Cell中含有15万个ZMW孔,而最新的Sequel平台配套的升级版SMRT Cell中含有100万个ZMW孔,进而通量提升7倍。

4DNA聚合酶和荧光标记dNTP

DNA聚合酶是实现PacBio测序超长读长的关键之一,SMRT测序中不含有PCR扩增,测序过程中,随着DNA聚合酶的合成反应,碱基配对并测序,因此酶活性决定了最终测序读长。另一方面,与现有二代测序技术将荧光基团标记在5’端甲基上不同,SMRT测序中dNTP的荧光基团标记在磷酸基团上,合成完成后随之脱落,与天然DNA链合成产物一样,保证了测序超长的读长。公司为了提升测序读长,对这些试剂进行不断优化。文章中经常看到的P4C2P5C3以及P6C4代表的就是不断升级的试剂。

SMRT测序原理

SMRT测序采用四色荧光标记的dNTPZMW孔完成了对单个DNA分子的测序。每个ZMW孔中,单个DNA分子模板与引物结合,然后结合DNA聚合酶后,被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTPDNA合成开始,连接上的dNTP会由于碱基配对在ZMW底部停留较长时间,激发后发出对应的荧光信号被识别,返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上,当上一个dNTP合成后,磷酸基团自动脱落,保证了检测的连续性,提高了检测速度,每秒钟合成3个碱基的速度,配上高分辨率的光学检测系统,实现了实时检测。

技术优势

1、超长的测序读长:平均测序读长达到10~15kb,最长可超过40kb

2、超高的准确度:测序深度达到30×时,准确度达到99.999%Q50

3、均一的覆盖度:无PCR扩增偏好性和GC偏好性

4、可直接检测碱基修饰:在进行基因组测序同时直接检测碱基修饰