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C系列技术

运用4C技术解析目标区域调控机制

染色质构象捕获(Chromatin Conformation Capture,3C)技术及其衍生技术正逐渐以越来越高的分辨率和深层次揭示细胞核构造,近年开发出基于染色质构象捕获而衍生的环状染色质构象捕获(circularchromosome conformation capture4C)技术[1,2],其能用于测定染色质目标区域与染色质其他区域(一点到多点之间)的交互作用。结合高通量测序技术,4C方法及其数据分析的敏感度和分辨率都相对3C有大幅提高。

拟解决问题

了解目标区域或基因trans(不同染色体之间)和cis(相同染色体内)互作区域,发现其新的调节区域、元件和基因等调节机制;

部分揭示宏观的染色体构造;

分辨率高,验证Hi-C目标区域;

流程图

甲醛固定细胞染色质,限制性内切酶酶切消化染色质—蛋白质交联物,蛋白酶K消化交联物以释放出结合的蛋白质,线性DNA经限制性内切酶二次消化,经过自环化,根据目标区域设计引物进行反向PCR,将PCR产物进行测序。4C技术特点就是将引物设计在一个已知序列上,通过反向PCR结合测序筛选出基因组中所有与已知序列相互作用的未知DNA片段。

                  

图1. 4C技术流程图[3]

产品特点

发现与目标区域相关的所有互作;

目标明确,测序量小,经济有效。

应用范围

人类基因组、细菌基因组,及其它模式生物基因组。

案例一

图2. β-球蛋白基因簇启动子-LCRlocus control region)区的互作

DNA调控元件能通过物理互作来调控远距离基因的表达。van de Werken HJ等人[3]利用4C技术结合高通量测序,在mESCsmouse embryonic stem cells)细胞中,分析验证了鼠Hbb-b1基因与HS2元件的物理调控及鉴定Oct4 启动子调控区域。图2a互作图分别展示了活跃(肝)和失活(脑)的Hbb-b1基因的互作情况,表明其与基因近端的HS1–HS2区显著互作;并用HS2作为viewpoint进行了验证(图2b),红虚线代表viewpointOct4是在ESCs中表达的多能基因,通过4C技术,以Oct4基因TSStranscription start site)附近区域为viewpoint,除了发现了位于上游(1kb2kb)已知的增强子区域外,还发现TSS上游17kb处的另一个特殊的显著互作区域(图2c,并且此两个区域(1,-1.5kb4,-17kb)用荧光报到实验得到了验证(图2c,d, *P 0.05)。

案例二

图3. 拟南芥(Arabidopsis)4C互作图展示

Stefan Grob等人[4]利用4C技术,分别从13viewpoint对拟南芥(Arabidopsis)进行染色体构造检测,揭示了线性组成的基因组在全基因区域的互作情况。Circos plots展示了不同4C viewpoint(不同颜色)全基因互作,转录率和染色体区域情况,图3a表示Trans-互作,图3b表示cis-互作,其中P < 10-3。图3c展示了4C viewpointFIS2基因的互作关系以及互作显著性,其中基因密度(蓝色圈)和转座元件密度(紫色圈)表明该区域为异染色质或常染色质区域。 

参考文献

1. Zhao Z, et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncoversextensive networks of epigenetically regulated intra- andinterchromosomal interactions. Nat Genet. 38:1341–47(2006).

2.  Simonis M, et al.Nuclear organization of active and inactive chromatin domainsuncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). NatureGenetics38:1348–54(2006).

3.    Werken HJ, et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNAinteractions. Nat Methods9:969–72(2012).

4.    Stefan Grob, et al. Characterization of chromosomal architecturein Arabidopsis by chromosome conformationcapture. Genome Biology 14:R129(2013).

Hi-C技术

Hi-CHigh-throughput chromosome conformation capture),是由Job Dekker研究团队于2009年开发的一种通过对3C交联片段高通量测序从而探索全基因组三维结构的技术。相比于其他C系列技术(3C,4C,5C),应用Hi-C我们可以获得全基因组所有位点间的互相作用,而不仅仅是局限于与靶位点相关联互作。

因为Hi-C可以分析一个物种全基因组所有位点之间的互相作用。该技术可以广泛应用于基因表达调控2,3,基因组空间高级结构及其在细胞周期中的变化4-7等多个领域。目前,该技术及被应用于涉及包括人类在内的动物6,植物8,真菌9,细菌7等多个物种。

拟解决的问题:

揭示全面且具体的功能性染色质相互作用

1.   全基因组范围内互作图谱

2.   全基因组范围内DNA折叠compartment信息

3.   全基因组范围内DNA折叠TAD信息

4.   DNA三维空间结构

主要应用领域:

1、绘制细胞核内互作染色质的空间构象;

2、解析全基因组范围内基因间整体相互模式;

3、辅助基因组组装拼接 

应用范围:

人类基因组、动植物基因组、真菌基因组、细菌基因组及其它模式生物基因组。

流程

用甲醛瞬时固定细胞内与蛋白质相互作用的染色质,限制性内切酶酶切消化,再将缺口进行补平(同时用dCTP进行生物素标记),连接酶进行连接,将样本进行超声破碎,随后用生物素亲和层析技术将片段沉淀,目标片段加上接头进行深度测序,最后进行高通量的数据分析以得到染色质的空间构象等需要的信息。

图1. Hi-C分析基本流程图1

案例一

2. 不同细胞系之间以及人类与小鼠间基因组比较3

Suhas S.P. Rao等人利用原位Hi-C技术分析研究了以人类为主的9种细胞的基因组三维结构3。他们在人类基因组上发现了约一万个环状结构(loops),loops不仅在人类不同细胞系中趋于保守(图2A),在人类与小鼠之间也存在大量保守的loops结构(图2BCDE)。

3. 位于启动子与增强子之间的loops与基因表达的激活密切相关3

他们还发现:位于启动子与增强子之间的loops与基因表达的激活密切相关。如图3A,显示在基因组中有很多启动子通过loops与增强子相连。图3B显示,仅在GM12878细胞系中存在的loops结构相关联基因表达量明显高于其他基因,反之亦然。图3B3D展示了两个因loops结构存在而激活基因表达的例子。

案例二

4. 新月柄杆菌三维基因组结构7

Tung B. K. Le 等人利用Hi-C技术分析了新月柄杆菌基因组,以揭示原核生物基因组三维结构7。如图(4)所示,他们发现:新月柄杆菌基因组的两个臂之间有明显互作(4A);与真核生物的TADtopologically associated domains)结构5类似;新月柄杆菌的基因组可以空间中折叠成多个相对独立的结构域(chromosomal interaction domains CIDs)。而这些CIDs的边界多为高表达基因富集区(4B);显微镜观察及HiC数据结合分析显示新月柄杆菌的基因组两个臂上延主干上分布着有DNA超螺旋形成的plectonemes4C);模拟结果显示,基因组上的非超螺旋区域(PFRs)可以促使CIDs边界的形成(4D)。

5. 抑制转录对CIDs边界的影响7

为进一步研究基因组空间结构与基因表达间的关系,经过比较使用转录延伸抑制剂rifampicin处理与未处理的新月柄杆菌Hi-C分析结果。如图5A5Brifampicin处理会破坏新月柄杆菌基因组上的CIDs边界。而另一项实验通过将高表达基因rsaA移动至低表达区域vanA,从而改变了原有的CIDs边界(图5C)。这两项实验都证明了高表达基因参与新月柄杆菌基因组上互作结构域边界的形成。

参考文献

1.  Lieberman-Aiden, E. et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science326, 289-93 (2009).

2.  Ay, F. et al. Three-dimensional modeling of the P. falciparum genome during the erythrocytic cycle reveals a strong connection between genome architecture and gene expression. Genome Res24, 974-88 (2014).

3.  Rao, S.S. et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell159, 1665-80 (2014).

4.  Pope, B.D. et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature515, 402-5 (2014).

 5.  Dixon, J.R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature485, 376-80 (2012).

 6.  Naumova, N. et al. Organization of the mitotic chromosome. Science342, 948-53 (2013).

 7.  Le, T.B., Imakaev, M.V., Mirny, L.A. & Laub, M.T. High-resolution mapping of the spatial organization of a bacterial chromosome. Science342, 731-4 (2013).

 8.  Feng, S. et al. Genome-wide Hi-C analyses in wild-type and mutants reveal high-resolution chromatin interactions in Arabidopsis. Mol Cell55, 694-707 (2014).

 9.  Mizuguchi, T. et al. Cohesin-dependent globules and heterochromatin shape 3D genome architecture in S. pombe. Nature516, 432-5 (2014).