在基因表达调控机制研究中，人们开发了多种方法来研究三维基因组中染色质的相互作用。荧光原位杂交FISH (fluorescence in situ hybridization)技术是通过荧光素标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，从而可以在显微镜下可视化细胞核内染色体或基因的状态，一直以来作为染色质构象捕获Hi-C技术互作信息的重要验证方法之一。TAD作为基因组三维结构的基本结构和功能单位，其大小通常在0.2-1 Mb之间，但一个典型的BAC克隆长达100-300kb，难以通过传统FISH技术来确认这些位于TAD内部的短程互作。染色质的短距离相互作用的成像目前仍然是技术瓶颈。

解决该问题的核心是如何聚集更多的荧光基团到很短的目标区域。针对此问题，清华大学高军涛研究组开发了一种分辨率可高达1kb、称为Tn5-FISH（基于Tn5转座酶的荧光原位杂交）的新技术（图1）（Niu J, et al. Journal of Genetics & Genomics 2020）。它借助于Tn5转座酶，通过“切割和粘贴”机制在将DNA切割成最短40 bp的小片段的同时，在片段两段添加已知序列的接头DNA序列，通过PCR扩增构建探针文库，从而标记细胞核内的染色质。

图1 Tn5-FISH技术原理

双方合作提供的Tn5-FISH技术的理论上的最大标记密度是每Kb 长度上有50个荧光分子，从而大大提高了信噪比，有助于将信号与背景区分开。它的分辨率比传统FISH高一两个数量级，和超分辨成像结合，可用于对各种染色质相互作用和目标位点进行定位和成像，尤其是互作距离短于一个BAC长度、不能通过传统BAC FISH所验证、但在TAD内部大量存在的相互作用。与传统FISH相比，Tn5-FISH无需BAC克隆，成本更低，速度更快，应用更灵活，结果更精准。

如图2A下方的蓝框所示，基于BAC克隆的传统FISH所无法成像的互作位点4和5（两个红色箭头所示），则可以使用Tn5-FISH进行成像：①橙色的BAC克隆由于横跨位点4和5，而不能用于对互作进行成像；②红色BAC克隆由于不能完全覆盖位点5，容易出现标记错误，也不能被选用；③紫色和绿色BAC克隆分别完全覆盖了位点5和4，但两个克隆间有重叠，因此也不能用于对这两个位点之间的互作进行成像。而分辨率更高的Tn5-FISH技术则可以对该互作位点进行成像。

图2  Tn5-FISH的独特之处、应用及专利转化

（A）Tn5-FISH可以对基于BAC克隆的传统FISH所无法成像的位点4和5（两个红色箭头所示）之间的相互作用进行成像（该图下方蓝框所示）。

（A-C）Tn5-FISH的独特之处及其在KRT基因簇上的一个应用。Hi-C频率矩阵（A）中的三个位点site 1、2、3（分别用红、蓝、绿的横条和箭头表示）之间的相互作用（用红色五星标出），可以用（B）中的三条橙色弧线来表示，并用（C）中的Tn5-FISH成像来进行验证。

（D）该技术已获得专利授权。

（E）Tn5-FISH的卡通示意图。该技术的本质，是在很短的目标区域内，聚集尽可能多的荧光基团。