近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所储明星研究员团队在Frontiers in Endocrinology上发表题为“Transcriptome Analysis Reveals Key miRNA–mRNA Pathways in Ovarian Tissues of Yunshang Black Goats With Different Kidding Numbers”的研究论文。研究利用mRNA和miRNA测序技术，对我国特色山羊品种-云上黑山羊的卵巢组织进行研究。通过构建miRNA-mRNA网络，筛选了调控山羊高繁殖力的潜在分子途径，并通过体外实验对候选基因及其调控基因进行了验证。确定了chi-miR-439-3p-JAK3调控通路，为云上黑山羊GC的增殖和繁殖力提供了新的视角。菲沙基因为本文共同作者，参与了本研究的测序和部分数据分析工作。

图1.文章信息

图2.技术路线

对10个山羊卵巢进行mRNA和miRNA测序，筛选出了28,618个mRNAs和1,038个miRNAs。在H组和L组之间鉴定出2,968个差异mRNAs（DEGs）和99个差异miRNAs（DEMs）。在H组和L组的比较中，有1,553个上调和1,415个下调的DEG，以及80个上调和19个下调DEM。

图3 卵巢中miRNA和mRNA的表达

将鉴定出的DEM和DEG整合为与山羊多羔性状相关的miRNA-mRNA网络。在H与L的比较中预测到了671对miRNA-mRNA靶向关系，具有表达负相关的有386对，这些可能在山羊多羔性状的分子机制中起关键作用。网络中，miR-93-3p是一个核心的miRNA，关联到73对miRNA-mRNA，其中29对呈负相关，另一个重要的核心miRNA是miR-493-3P，能关联到JAK3、MPDZ等7个基因，这些基因与JAK-STAT信号通路、紧密连接和PI3K-Akt信号通路密切相关。已有研究表明，PI3K-Akt和JAK-STAT信号通路与卵巢功能相关，如GC的增殖、卵母细胞的成熟等。因此选择了miR-493-3p和JAK3，用于后续山羊多羔性状相关的研究。

图4. 差异miRNA-mRNA互作网络

进一步研究DEG-DEM在不同生育性能组之间的作用，对差异miRNA靶向的mRNA进行了GO和KEGG富集分析。GO富集条目包括JAK-STAT对受体信号通路的正向调节、雌激素生物合成过程、雌激素代谢过程和卵巢卵泡发育；KEGG途径富集到与性状相关途径为GnRH信号通路、卵母细胞减数分裂、PI3K-Akt信号通路等。在JAK3、ADCY3、ADCY6、IKBKB等8条途径中共发现了21个DEGS，这些是进一步研究的重要候选基因。

使用差异基因构建PPI网络，网络关键节点为ITGB1、IRF4、ACTN4等，这些节点同时也是差异miRNA的靶向mRNA。同时随机选择了10个DEG-DEM对，进行PCR验证，结果表明，mRNAs和miRNAs的表达水平与RNA-seq一致。

图5. 富集分析和差异蛋白PPI网络

GCs的增殖是哺乳动物排卵的必备，为了揭示山羊多羔性状的分子机制，进一步研究了JAK3在山羊GC中的作用。WB结果显示H组的JAK3蛋白表达显著高于L组，而mRNA表达却相反，表明JAK3的表达受转录后miRNA的调控。系统发育分析表明，JAK3在不同物种中高度保守，因此研究推测JAK3的功能可以与其他物种相似。为了进一步研究JAK3对GC增殖的影响，构建了JAK3过表达和siRNA载体。发现JAK3的过表达可以促进山羊GC的增殖，而si-JAK3则呈现相反的结果，这表明了JAK3可以促进山羊GC的增殖。

图6. JAK3促进GC增殖

差异miRNA和mRNA的分析发现，JAK3是chi-miR-493-3P的靶标之一。双荧光素酶报告法也验证了chi-miR-493-3p和JAK的靶向关系，结果表明JAK3是chi-miR-493-3p的直接靶点。研究进一步构建了山羊GC的chi-miR-493-3p的过表达和抑制模型，通过检测增殖相关的基因及相关指标，发现chi-miR-493-3p过表达会抑制GC的增殖，而抑制其后会出现相反的结果，这表明chi-miR-493-3p对山羊GC的增殖有抑制作用。同时研究还通过EISA法检测雌二醇和孕酮发现，chi-miR-493-3p可以通过调节JAK3的表达从而影响山羊GC中类固醇激素的合成。

图7. Chi-miR-493-3p对山羊GC细胞中JAK3的影响

研究通过miRNA和mRNA测序，构建了不同繁殖性能的山羊的差异miRNA-mRNA调控网络，进而筛选出了候选关键通路。也通过试验验证了关键的靶向关系。在体外实验进一步构建过表达与沉默模型，对关键调控通路chi-miR-439-3p-JAK3进行了进一步研究，确定了chi-miR-439-3p的调控作用，确定了chi-miR-439-3p-JAK3对GC增殖和繁殖力的影响，为后续研究提供了新的视角。