图1 RNA中的常见修饰

m6A修饰是真核细胞中常见的修饰，在不改变碱基序列的前提下，对RNA的转录、剪接、翻译等过程起到调控作用。整个修饰过程普遍认为是动态的、可逆的，能够影响mRNA的代谢并调控RNA的转录、输出、剪接、降解和翻译。m6A的整体过程基于三个组件进行分别为“Writers”、“Readers”、“Erasers”。

图2 m6A过程示意图

m6A的检测方式多种多样，从上世纪70世纪第一次发现RNA中的m6A开始，就陆陆续续有多种检测技术的诞生，但是很多技术都被实验设备和工具等显著，没有广泛的进行。2012年才首次出现使用高通量技术去鉴定人和小鼠m6A甲基化水平的文章，二者也先后发表在Nature和Cell上。使用的方法也就是MeRIP-seq或现在普遍称呼的m6A-seq。其基本原理其实就是通过m6A抗体与m6A的mRNA片段结合，再进行测序，最高可以达到100nt的分辨率。

2015年在MeRIP-seq的基础上也有可以做到单碱基分辨率的miCLIP-seq方法的出现，但是实验中存在同位素添加等过程，无疑提高了实验成本和操作的难度，所以实际去进行的实验室并不多。

现在对于m6A修饰也涌现了很多新方法，其中具有代表性的就是Direct RNA测序，通过独特的建库方式，依托算法，可以达到对RNA单碱基水平修饰信息的收集，这无疑是对m6A检测打开了另外一个方向。已经有研究利用Direct RNA 测序技术探究人、拟南芥等物种的m6A修饰，文章也陆续发表在Cell、Nature methods、advanced Science等高水平期刊上。

图3 Direct RNA研究基本路线

研究方式：CRISPR技术、m6A-seq、IP-qPCR

研究内容：

研究通过利用CRISPR技术构建了拟南芥FIONA1的突变体，并发现FIONA1是拟南芥U6 m6A甲基转移酶，课件m6A安装在U6 snRNA和一部分的Poly(A)和RNA中。同时研究发现，FIONA1的缺失会导致光敏色素信号识别紊乱以及光周期出现错误，从而引起下胚轴伸长和提前开花。与其他物种如哺乳动物中的METTL6不同，在正常或高水平 SAM 条件下，FIONA1 既不将 m6A 安装在拟南芥 SAM 合成酶的 mRNA 中，也不影响其转录水平。研究证实 FIONA1 可以在体外和体内甲基化植物 mRNA m6A 基序。进一步研究表明 FIONA1 在几个表型相关的转录本中安装 m6A，从而影响下游 mRNA 稳定性，并调节光敏色素信号传导和成花转变。

图4 成花的转变需要FIONA1的甲基化活性

研究方式：LC-MS/MS、Direct RNA-seq、IP-qPCR

研究内容：

FIONA1蛋白定位于细胞核中，包含一个甲基转移酶功能域，是人METTL16的同源蛋白。该研究发现，缺失FIO1导致拟南芥整体m6A甲基化水平下降，并呈现出早花表型。通过Nanopore 纳米孔直接RNA测序，作者比对了FIO1突变体和野生型之间差异化的m6A修饰，共检测到3459个低甲基化位点且分布于2068个蛋白编码基因中。这些低甲基化位点主要集中在CDS（79.6%）偏向终止密码子区域。此外，作者还鉴定到一个独特的甲基化修饰模体YHm6AGA (Y = C/U; H = C/A/U)。这些特征明显区别于植物体内已知m6A甲基转移酶复合体呈现的特点。进一步的研究发现，FIONA1可在体外催化RNA的甲基化反应并且FIONA1的催化失活突变体不能挽救FIONA1的早花表型。这些结果表明，FIONA1的甲基转移酶活性是拟南芥开花调控所必不可少的。

图5 整体研究思路

上述两篇文献研究内容都是基于拟南芥的FloNA1开展，研究其对于甲基化的调控作用，以及调控后所带来的生物体变化，最后的结论也可以在一定程度上互相印证，虽然使用的研究方式各有不同，但是最后都能够达到识别甲基化修饰、验证甲基化调控的一个基本目的。这说明无论是m6A-seq或Direct RNA-seq都可以是m6A甲基化研究的重要工具。