近日，浙江大学医学院基础医学系干细胞与再生医学中心/浙江大学医学院附属第一医院/浙江省良渚实验室张进课题组在Nature Communications杂志上发表题为“rRNA Biogenesis Regulates Mouse 2C-like State by 3D Structure Reorganization of Peri-Nucleolar Heterochromatin”的研究论文。该研究通过多组学数据整合挖掘与分子实验相结合的研究策略首次发现了rRNA介导的核仁相分离和核仁周边异染色质的高级染色质结构能够调控ES细胞向2C-like细胞的命运转变；同时发现了rRNA生物发生是调控小鼠二细胞胚胎到四细胞胚胎转变的关键分子开关。该研究提供了一种将ES细胞重编程回2C-like细胞的潜在新方法，并加深了研究人员对干细胞命运决定和早期发育中核仁功能的理解。菲沙基因承担该研究的Hi-C建库测序工作。

材料：材料：小鼠胚胎干细胞（mES细胞）

方法：

• 组学数据：RNA-seq，10x scRNA-seq，ChIP-seq，Hi-C，ATAC-seq；

• 其它：FACS分选，免疫荧光染色，光脱色荧光恢复技术（FRAP），siRNA敲除，DNA FISH，qRT-PCR，透射电子显微镜（TEM）；

1、抑制rRNA生物合成激活2C-like转录并诱导2C-like细胞转化

研究者对三种抑制剂（CX-5461，鱼藤酮和雷帕霉素）处理后的mES细胞进行RNA-seq，只有CX-5461处理活化了二细胞胚胎的marker基因（Zscan4d, Dux和Gm12794）和抑制多能态基因（Pou5f1），激活GSAT_MM，MERVL-int和MT2_Mm等转座子重复序列，并且无监督k-means聚类显示该抑制剂增多了小鼠胚胎着床前的二细胞和二细胞/四细胞基因。联合着床前小鼠胚胎细胞和2C-like细胞的公共转录组数据的聚类分析以及rRNA定量证实，CX-5461抑制rRNA生物合成后激活了mES细胞的2C-like转录程序。

和上面结果类似，scRNA-seq数据分析中CX-5461处理后2C marker基因明显上调，并且显著上升的MERVL表达与核糖体蛋白基因显著负相关。控制MERVL启动子的2C::tdTomato reporter结合FACS观察2C状态的结果也与单细胞水平发现一致，tdTomato positive (2C::tdTomato⁺) mES细胞的增加和CX-5461施加剂量有关且非凋亡通路活化所致，因而抑制rRNA的生物发生诱导ES细胞向表达MERVL的稳态转变，核糖体基因与2CLCs为抑制关系。

图1 CX-5461抑制rRNA生物合成后激活了mES细胞的2C-like转录程序

2、抑制rRNA生物发生破坏核仁相分离和核仁周边异染色质

rRNA生物发生在核仁相分离中发挥关键作用，研究者利用电子显微镜结合免疫荧光技术以及FRAP分析了CX-5461处理前后mES细胞核仁相分离的变化情况，发现CX-5461处理影响了核仁正常相分离，关键蛋白NCL、NPM1以及RPA194介导的相分离液滴流动性明显增加，NCL和NPM1在核仁致密纤维成分（DFC）层中形成的独特环形结构消失。

在相分离调节染色质表观状态的基础上，研究者下一步以Inactive Hub、核仁相关结构域（NAD）和LINE1三个区域为重点，检测CX-5461处理引起的核仁周边异染色质变化。利用ChIP-seq（H3K9me3，H3K27me3，H3K4me3和H3K27ac）以及ATAC-seq技术，发现这三个区域的染色质开放性增加，活跃性的表观修饰H3K4me3和H3K27ac水平明显增加，抑制性的表观修饰H3K9me3和H3K27me3水平明显降低。已知NCL/TRIM28复合物通过在ES细胞中维持核仁异染色质区以抑制2C-like，NCL在核仁DFC层中形成的独特环形结构消失，提示抑制rRNA生物发生解除了NCL/TRIM28复合物对核仁异染色质区的结合，随后利用ChIP-seq(NCL和TRIM28)验证发现，CX-5461处理后NCL/TRIM28复合物对核仁异染色质区的结合明显降低。

图2 抑制rRNA生物发生破坏核仁周边异染色质

3、Dux激活2C/ERV基因

参考Dux表达受核仁蛋白NCL影响的报道，研究者猜想它作为关键调控因子参与了CX-5461抑制rRNA生物合成后激活mES细胞的2C-like转录程序，因而先通过公开发表的ATAC-seq、RNA-seq、ChIP-seq（P53，Dux）测序数据找到主要受CX-5461抑制剂影响的表达基因、染色质开放性和转录因子结合性，随后通过ChIP-qPCR和ATAC-seq测序实验分析Dux沉默以后CX-546诱导的2C基因中H3K9me3和H3K27me3水平，以及Dux结合位点和开放性变化，结果进一步研究发现rRNA生物合成抑制确实是通过Dux来激活2C基因。

图3 Dux激活2C/ERV基因

4、抑制rRNA生物发生引起趋向2C-like的核仁周边异染色质和MERVL区域的三维染色质结构重组

核仁异染色质区表观遗传状态的变化提示研究人员其染色质高级结构发生了变化，且已有研究报道2CLCs相对于mES细胞的三维结构可塑性增加。研究者进一步利用Hi-C测序技术得到每个样本>400百万条原始序列，解析了CX-5461处理前后mES细胞染色质高级结构的变化情况，尤其是核仁异染色质区以及其和Dux位点的相互作用，并且结合DNA FISH技术和小鼠着床前胚胎发育的公共Hi-C数据对互作变化予以验证。同时比较CX-5461处理mES细胞前后以及2C胚胎和内细胞团（ICM）之间多个区域的互作变化并进一步分析，发现CX-5461处理后ES细胞核仁异染色质区和MERVL区域的3D基因组高级结构与2C胚胎更为相似。

图4 抑制rRNA生物发生引起趋向2C-like的MERVL区域三维染色质结构重组

5、rRNA生物合成是调控二细胞胚胎向四细胞胚胎转变的关键因素

在上述基础上，本研究进一步通过细胞遗传学手段得到两种rRNA生物合成被干扰的mES细胞系，然后从目标位点相互作用、NCL和NPM1蛋白流动性、2C基因以及tdTomato⁺四个层面，发现干扰rRNA生物合成过程中的步骤可以重现了CX-5461诱导得到的2C-like细胞分子表型。

最后，本研究利用着床前小鼠各个时期的胚胎上进行了实验，对rRNA表达变化、RNA聚合酶Ⅰ（Pol I）的不同亚基基因表达水平和核糖体生物发生基因等进行定量分析，发现rRNA随着发育逐渐累积，二细胞到四细胞胚胎期间rRNA生物发生率达到顶峰且ERV和2C基因减少，且CX-5461处理小鼠早期胚胎时二细胞到四细胞胚胎期间的囊胚形成率下降幅度最大，因此rRNA生物发生在二细胞到四细胞的转变过程中最为关键。而在桑葚胚/囊胚抑制rRNA生物发生后的NPM1和NCL环形结构消失，2C基因的增加趋势也证实了rRNA生物合成是调控二细胞胚胎向四细胞胚胎转变的关键调控因素。

图5 rRNA生物合成是调控二细胞胚胎向四细胞胚胎转变的关键因素

该研究报道了核仁rRNA生物发生和PNH高级三维染色质结构重塑可能在二细胞向晚期转化过程中协调作用，发现体外培养的mES细胞在抑制rRNA生物发生下可以转化为2C-like细胞。提出了rRNA生物合成调节小鼠2C-like状态的机制模型。即在未受干扰的小鼠胚胎干细胞中，rRNA生物发生介导的核仁完整性维持正常核仁的液-液相分离(LLPS)和核仁周围异染色质(PNH)。这种正常核仁LLPS促进NCL/TRIM28复合物占据Dux locus并抑制Dux表达。而在抑制rRNA生物发生的小鼠胚胎干细胞中，核仁的天然液相被破坏，导致NCL/TRIM28复合物从PNH中分离，并改变PNH的表观遗传状态和三维结构，最终导致Dux从PNH区释放、2C-like程序激活和mES细胞向2C-like细胞的转化。

图6 rRNA生物合成调节小鼠2C-like状态的机制模型