近日，山西农业大学动物科学学院刘文忠教授团队在Animals期刊发表了题为“Hybrid Sequencing in Different Types of Goat Skeletal Muscles Reveals Genes Regulating Muscle Development and Meat Quality”的研究论文，该研究采用二代测序与三代全长测序结合的方法，对山羊骨骼肌进行研究，探究影响山羊骨骼肌发育和脂质代谢的关键基因。菲沙基因承担本研究中的转录组测序、分析等工作。

山羊（Capra hircus），主要经济产物为肉、奶和羊毛。在几个经济性状中，肉产量和品质是对养殖户和消费者相当重要的关键性状，且消费者对于山羊背部和后肢肉具有偏好性。但是山羊肉产量和品质同时受到遗传和环境因素的控制，并且现在对于山羊肌肉发育和肉质的遗传机制研究有限。

实验材料：四只山羊，分别取背最长肌和股二头肌

测序平台：illumina测序+PacBio测序

技术路线：

1、屠宰性能和肉质

通过对山羊的平均体重和胴体重进行检测，分析屠宰后大、小腿肌肉参数。对山羊背最长肌（LD）和股二头肌（BF）的肉品质进行研究。

表一 山羊背最长肌和股二头肌肉质分析

2、转录组特征分析

使用二代和三代测序全面检测山羊LD和BF的转录组信息，构建8个RNA-seq文库。对文库进行illumina测序，得到196,018,497 clean reads，每个文库大约93.2%的clean reads可以匹配到参考基因组。使用PacBio SMRT测序，从不同片段文库中获得144,625（1-2kb）、133,687（2-3kb）、135,310（3-6kb）的ccs序列。使用RNA-seq数据纠错后得到225,417个高质量FLNC片段，平均长度2138bp。从中鉴定出了18,419个基因座和45,574个转录本。结果表明，72.43%的多外显子转录本和90.50%的FLNC为全长。

图1 山羊参考基因组与本研究获得的PacBio数据比较

3、Isoforms和AS分析

在于参考基因组比对后，对全长转录本进行了分类。共鉴定出了6966个新基因，包含7420个isoforms。新的isoforms与NR、GO、KOG、KEGG和Swis-Prot数据库进行注释比对，比对率分别为72.79%、29.84%、49.68%、4.15%和25.22%。同时结合三代测序的长度优势，鉴定出了2745个lncRNAs。并对全长转录本进行了选择性剪接（AS）事件分析。鉴定了五种选择性剪接的发生情况。

图2 AS事件统计

4、整体表达水平分析

8个文库中，超过87%的外显子达到了90-100%的覆盖率。在BF中鉴定出了1059个特有基因和4625个特有isoform，在LD中鉴定出了703个特有基因和4059个特有isoform。并且对不同样本进行相关性分析。

图3 样本相关性分析

5、不同肌肉中差异基因及转录本分析

为了进一步检验两种肌肉类型之间的基因表达模式差异，对两个组织的转录组进行比较分析。发现在BF和LD中共鉴定出了231个差异基因和1173个差异转录本。对比发现2+3的测序策略会比单纯的二代测序鉴定的更加全面。通过聚类分析，发现同一类型的肌肉在不同个体间也具有高度相似的基因表达水平和模式，而不同类型的肌肉则具有不同的模式。对差异基因进行GO和KEGG富集分析，GO发现其在分子功能、细胞成分和生物学过程都具有许多差异。功能注释发现，这些GO条目主要参与骨骼肌生长和肉质的生物学过程，这些基因的作用于肌肉组织和纤维发育、骨纤维转变、脂肪发育和代谢以及胶原形成高度相关。KEGG途径分析表明，差异基因主要集中于油脂代谢、酮体合成和降解、不饱和脂肪酸生物合成和鞘磷脂代谢。

图4 差异基因GO和KEGG分析

在本研究中，利用二代和三代测序技术对调控山羊肉质和肌肉发育的基因进行了筛选。对两种具有代表性的骨骼肌进行了转录组比较。发现了231个差异基因，其中45个是新鉴定的基因。此外还发现了1173个差异转录本，其中642个为新鉴定的转录本。对差异基因和转录本进行了功能注释和通路分析，鉴定到了可能决定肉质和产量的关键基因，但是还需要进一步实验验证。

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表二 菲沙基因2021年转录调控项目文章（部分）