铁皮石斛(Dendrobium officinale)隶属于兰科石斛属,是我国特有的名贵中药材,其具有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等杰出功效,被誉为中华“九大仙草”之首,且已被列入《中华人民共和国药典》与药食同源目录。但由于缺乏高质量的参考基因组,近年来铁皮石斛功能基因组与分子育种研究进展较慢。
近日,南京师范大学生命科学学院丁小余教授团队在药学TOP期刊Acta Pharmaceutica Sinica B(IF=11.413)上发表了题为“The chromosome-level reference genome assembly for Dendrobium officinale and its utility of functional genomics research and molecular breeding study”的研究论文,该研究构建了首个染色体水平的铁皮石斛基因组,结合比较基因组、转录组、化学成分分析等方法对铁皮石斛重要次生代谢产物的关键酶基因进行了挖掘,并通过GWAS分析初步确定了与铁皮石斛产量相关的基因,为铁皮石斛功能基因组学和分子育种研究提供了新见解。菲沙基因承担了本研究中基因组的测序、组装和注释等工作。
图1 文章发表信息
研究背景
铁皮石斛(Dendrobium officinale)在中国作为药用和保健食品已经有近千年的历史,但其药用成分生物合成的分子机制仍不清晰,此外铁皮石斛还存在着分类学鉴定困难、育种繁殖缓慢等问题,而高质量的参考基因组则可为上述问题提供新的解决方案。目前铁皮石斛仅有基因组草图(Contig N50=4.7kb、Contig N50=33.1kb),因此构建高质量染色体水平的铁皮石斛基因组具有重要意义。
研究思路
材料:铁皮石斛(来自安徽)、重测序材料43份
测序策略:基因组组装(PacBio+Hi-C)、重测序(平均8×/个体)
组学思路:基因组+转录组+重测序
图2 研究技术路线
研究结果
铁皮石斛基因组的组装、注释
通过PacBio测序和Hi-C辅助组装,研究者获得了首个染色体水平的铁皮石斛参考基因组,其基因组大小为1.23Gb,Contig N50=1.44Mb,随后通过BUSCO评估、二三代数据回比证实了参考基因组的准确性。
通过从头预测、转录组、同源注释等方法,研究者发现铁皮石斛基因组中重复序列占比76.77%(其中59.72%为LTR),共预测得到27631个蛋白编码基因,还鉴定到1523个非编码RNA,包括57个miRNA、498个tRNA、684个rRNA、284个snRNA等。
图3 染色体水平的铁皮石斛参考基因组
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铁皮石斛的基因组特征及比较基因组学分析
研究者在铁皮石斛基因组中鉴定得到大量的Gypsy和Copia元件,发现Gypsy主要分布在高GC区域,Copia主要分布在低GC区域。此外,通过与已发表的铁皮石斛v1和v2版本基因组相比,研究者鉴定到了大量的SNP、InDel以及PAV,其中SNP和InDel主要分布在基因密度比较高的区域,而PAV则主要分布在密度比较低的区域。
通过基因家族聚类分析,研究者发现铁皮石斛特有的基因家族主要富集在与环境适应和次级代谢产物生物合成相关的通路中;系统进化分析表明铁皮石斛与桃红蝴蝶兰亲缘关系最近,两者大约在66.4百万年前产生分化;WGD分析表明,铁皮石斛经历了两次WGD事件,还有一次因LTR插入引起的Ks变化;基因家族收缩与扩张分析表明与多糖、生物碱和黄酮类化合物合成相关的基因在铁皮石斛中得到大规模的扩张。
图4 铁皮石斛的比较基因组学分析
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次生代谢产物合成相关基因鉴定
多糖、生物碱和类黄酮是铁皮石斛主要的功效成分,通过同源搜索和功能注释,研究者鉴定到了268个基因(包括56种酶)与多糖合成相关,注释到98和52个基因与生物碱和类黄酮生物合成相关,这些基因主要参与了次生产物合成的上游途径。
水杨酸(SA)可显著增强植物的抗性,研究者以对照和SA处理35天的样品进行转录组分析,结合化学成分测定对铁皮石斛中与多糖、生物碱和黄酮类药用活性成分合成相关的关键酶基因进行了挖掘,找出了107个与次生代谢生物合成相关的差异基因。
此外,研究者还对石斛中的P450基因家族进行了分析,在对照组和SA处理组中鉴定了29个差异表达的CYP450基因,其中26个属于CYP71家族,这表明CYP71在调控铁皮石斛次生代谢(尤其是黄酮化合物)合成中发挥重要作用。
图5 铁皮石斛中次生代谢产物的生物合成途径
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铁皮石斛的群体GWAS分析
通过选取13个地区的38份材料,结合5个近缘种,研究者对43份材料进行了GWAS分析,鉴定到了4个株高性状相关基因、两个叶长性状相关基因以及3个茎尖、1个节间长度性状相关基因。其中,MWL1基因主要负责细胞壁生长,促进株高生长,可能有助于铁皮石斛产量的变异。
图6 铁皮石斛群体的GWAS分析
总 结
研究者通过PacBio和Hi-C构建了首个染色体水平的铁皮石斛基因组,并通过包含转录组与重测序在内的多组学分析,深入挖掘了与铁皮石斛重要次生代谢产物合成相关的关键酶基因,并进一步鉴定了与铁皮石斛产量相关的候选基因,从而为铁皮石斛功能基因和分子育种的研究提供了新见解。
原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521000332