组蛋白的翻译后修饰主要包括甲基化、泛素化、磷酸化和乙酰化，可以改变染色质结构并调节基因表达和细胞过程。H3K36甲基化通常与转录激活相关，并且可以和其他组蛋白修饰一起调节基因。NSD1介导的H3K36me2抑制全基因组内H3K27me3扩增，这种相互作用将H3K36me2与活性基因表达连接了起来。目前已知，神经母细胞瘤、胃肠道癌、头颈部肿瘤、神经胶质瘤、小儿急性髓性白血病和Sotos综合征中存在NSD1突变。此外，H3K36me2的丰度适度增加会激活转录异常甚至促进癌症发展，H3K36me2调节基因表达的分子机制却有待认识。
2021年6月9日，浙江大学生命科学院方东研究员课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表了题为“The H3K36me2 methyltransferase NSD1 modulates H3K27ac at active enhancers to safeguard gene expression”的研究论文。该研究发现NSD1缺失导致了数量相当的上调基因和下调基因，而基因表达下调与H3K36me2的减少相关。另一方面，在NSD1缺失时，活跃增强子的H3K27ac修饰增强，促进了中胚层分化相关基因的表达升高。同时，该研究也提出了NSD1可以招募H3K27ac去乙酰化酶HDAC1来共同调控活跃的增强子激活情况，为H3K36me2在基因表达调节中的功能提供了新见解。
实验材料：小鼠胚胎干细胞（J1 mESC）
测序技术：CUT&RUN，CUT&Tag，RNA-seq，ATAC-seq
研究结果
1.NSD1 KO mESC中的上调基因和下调基因
NSD1催化H3K36me2。研究通过CRISPR/Cas9系统敲除mESC中的NSD1，得到两个纯合突变的单克隆细胞（NSD1 KO细胞）。它们的H3K36me2水平下降，H3K27me3水平上升，其它组蛋白则变化不明显。WT细胞和NSD1 KO细胞的RNA-seq结果显示，无论是编码基因还是长链非编码基因，NSD1 KO细胞中的上调数量和下调数量接近。随后，ATAC-seq结果进一步显示，NSD1 KO细胞中上升和下降的染色质开放区域peaks数目相近，它们的转录因子（TF）motifs富集差别很大，因此敲除NSD1会影响活跃基因和抑制基因的表达。
NSD1 KO vs WT(RNA-seq和ATAC-seq)
2.NSD1 KO mESC中活跃增强子的H3K27ac修饰增强
该研究利用CUT&RUN得到H3K36me2、 H3K27me3和H3K27ac在野生型和NSD1 KO细胞的信号分布。
首先确定转录起始位点上下3KB的H3K27me3和H3K27ac的富集情况，然后通过比较野生型和NSD1 KO细胞中活性/抑制启动子区的组蛋白修饰水平进一步确认，结合ATAC-seq。结果显示，在敲除NSD1后，H3K36me2水平和染色质开放程度显著下降，并且H3K27me3信号在活跃启动子区增加，在抑制启动子区降低，H3K27ac水平则不因启动子活性变化而显著改变。
进一步分析增强子区域的H3K27me3和H3K27ac富集水平，探究mESC中基因表达的潜在机制。当NSD1被敲除时，活跃和抑制增强子区的H3K36me2水平均降低。并且，抑制增强子区的H3K27me3和活跃增强子区的H3K27ac修饰增强，染色质开放程度也出现类似的变化。此外，ChIP-qPCR证实，NSD1 KO细胞中非活跃启动子和增强子的H3K27me3，以及活跃增强子区的H3K27ac修饰都增强，H3K36me2水平下降。
H3K27me3和H3K27ac修饰变化
3.活跃增强子的H3K27ac修饰增强与中胚层分化富集基因的表达增加有关
与亲本细胞系相比，两个NSD1 KO细胞系中与活跃增强子相关的基因表达水平均显著升高。此外，在野生型和NSD1 KO细胞中，受抑制的增强子相关基因的表达水平没有改变。
对H3K27ac修饰增强的活跃增强子区基因进行GO富集分析，研究发现2228个基因大量富集于Wnt信号通路，Wnt信号通路在中胚层分化的调控中起着重要作用，并且Wnt信号自身活性没有因敲除NSD1而受到干扰。随后，检测野生型和NSD1 KO细胞中多能性、外胚层、中胚层、滋养外胚层、2细胞和印迹marker的表达水平，并且将它们与增强子区域H3K27ac的富集变化进行关联，结合野生型和NSD1 KO在胎体形成前的细胞分化marker表达变化。结果表明，活跃增强子的H3K27ac修饰增强，至少部分影响了Wnt相关基因以调节mESC向中胚层细胞的分化。
H3K27ac修饰增强的活跃增强子区基因大量富集于Wnt信号通路（箭头处）
4.mESC中NSD1对HDAC1的招募
关联分析发现，野生型细胞的活跃增强子中H3K27ac变化与H3K36me2直接相关，H3K27ac与H3K27me3的变化则相关性很低。H3K27ac增加不太可能是由H3K27me3改变引起的。
为了深入探究NSD1 KO细胞中H3K27ac增加的潜在机制，该研究在mESC中过表达FLAG标记的NSD1并进行免疫沉淀(IP)耦合质谱分析，同时评估乙酰转移酶和去乙酰化酶等与NSD1相关的蛋白质，确定了HDAC1与NSD1的相互作用。HDAC1不因NSD1被敲除而表达水平发生变化，并且HDAC1的CUT&Tag结果显示其显著富集于启动子区与基因间区。随后分析HDAC1在启动子和增强子上的富集信号，启动子和增强子无论处于活跃或抑制状态，HDAC1在NSD1 KO细胞中启动子和增强子处的富集都较之野生型的显著降低，IGV可视化和ChIP-qPCR对此进一步证实，再考虑到HDAC1的变化与增强子和启动子的H3K36me2相关性很好，因此NSD1的缺失导致HDAC1在启动子和增强子的招募受阻。
HDAC1在NSD1 KO细胞中启动子和增强子处的富集都较之野生型的显著降低
5.HDAC1和NSD1 KO mESC中H3K27ac增加的活跃增强子大部分重叠
启动子和增强子区域的HDAC1在NSD1 KO同时降低，而NSD1 KO细胞中活性增强子区域只有H3K27ac增加，因此其他HDACs可能在这些位点上富集并作为H3K27ac的补充调节因子。
研究通过CRISPR/Cas9系统敲除mESC中的HDAC1，得到两个纯合突变的单克隆细胞（HDAC1 KO细胞），然后通过对野生型细胞和HDAC1 KO细胞中进行H3K27ac和HDAC1的CUT&Tag，阐明HDAC1 KO影响H3K27ac的具体细节。结果显示，HDAC1 KO细胞中HDAC1信号只在活跃增强子显著增加，和NSD1 KO细胞中H3K27ac只在活跃增强子增加的变化一致。结合IGV可视化和ChIP-qPCR观察基因间区以及启动子和增强子区域的H3K27ac和HDAC1变化，两者相关性很强。此外，HDAC1 KO细胞和NSD1 KO细胞中H3K27ac修饰增强的活跃增强子重叠幅度有50%以上。因此敲除HDAC1增强的是活跃增强子区H3K27ac修饰，而不是启动子区H3K27ac。
HDAC1 KO细胞和NSD1 KO细胞中H3K27ac修饰增强的活跃增强子
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参考文献：
Fang Y, Tang Y, Zhang Y, et al. The H3K36me2 methyltransferase NSD1 modulates H3K27ac at active enhancers to safeguard gene expression[J]. Nucleic Acids Research, 2021.
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