对12个新冠患者和6个健康样本的外周血，采用荧光活性细胞分选（FACS）分离CD³⁺ T细胞，采用10x Genomics 5`端建库，采用Illumina’s Novaseq 6000进行PE150测序，其他病毒感染样本数据从VDJdb (https://vdjdb.cdr3.net)数据库下载。克隆型的鉴定和注释采用cellranger vdj进行。

测序对新冠和健康样本分别获得22407和37282个具有完整αβ链的T细胞。当被抗原激活时，T细胞会发生克隆扩增（T细胞大量增值以产生相同的TCR序列）。为了研究新冠患者体内的TCR偏好，分析发现新冠和健康样本间细胞的TCR序列唯一性程度有差异（新冠中占25%的细胞扩增，健康样本为17%）（图1a）。CDR3序列长度分析发现患者和正常样本没有差异，但是在扩增型的TCR序列中，新冠患者中具有相同CDR3长度的细胞比例要高于正常样本（图1b），克隆型多样性指数Shannon新冠患者也明显低于正常样本（p = 1.08e-4，图1c）；在疾病特异的TCR序列中，505个为克隆扩增，约占全部扩增型TCR的99.21%（图1d）。

图1 COVID-19和正常样本的TCR克隆扩增

V（D）J重组决定了TCR的特异性，分析首先对单个的V和J基因进行，比较发现了患者和正常样本之间差异使用的V和J基因区段（α或β链）（图2a），新冠患者中，最常使用的基因区段为TRAV12-2，TRAJ49，TRBV20-1和TRBJ2-7；与正常样本相比，TRAV4、TRAJ27、TRBV4-2和TRBJ2-6在新冠患者中使用明显升高；随后，对α和β链的VJ对单独比较发现，新冠患者中有1876个唯一的TRAV-TRAJ对（α链），其中1827个与正常样本共有，呈现明显的共有性，新冠和正常样本分别有大于99%和98%的细胞表达这些共有VJ对（图2b）；对共有的VJ对做差异分析，鉴定了122个差异使用的VJ对，其中有四对在新冠中上调（TRAV23/DV6-TRAJ13，TRAV26-1-TRAJ26，TRAV8-1-TRAJ32和TRAV29/DV5-TRAJ44），其余118对下调（图2c，d）。对β链的分析结果与α链结果类似（图2b，c，d）。基于αβ链VJ分析，患者和正常样本之间仅有1634个αβ VJ对共有，比例较低（图2b），表达这种共有的αβ VJ的细胞分别只占11.76%和7.74%，差异分析鉴定了19对的差异αβ VJ对，其中，COVID-19患者中对高频率为TRAV12-2-J27-TRBV7-9-J2-3，健康样本为TRAV12-2-J12-TRBV12-4-J2-3（图2e）。

图2 新冠和健康样本间的TCR V和J基因使用比较

从VDJdb (https://vdjdb.cdr3.net)下载12种病毒的单细胞TCR数据用于后续分析。与新冠类似，其他病毒感染样本大部分的TCR也呈现唯一性（图3a），且COV-19患者的克隆扩增比CMV和YFV高，但低于EBV和Influenza A患者（图3b），随后进行克隆多样性指数Shannon比较，EBV感染的样本呈现最高的克隆多样性（图3c），相似性分析表明新冠和其他病毒感染样本的克隆相似性较低（图3d）；在扩增型的TCR序列中，新冠患者中具有相同CDR3β长度的细胞比例要明显高于CMV感染样本（图3e）。对VJ gene的使用上，新冠患者α链的VJ对使用与其他病毒样本最有一致性（特异性为13%）（图3f），β链的特异性更低，仅有3%（图3g）。

图3 新冠和其他病毒感染样本TCR克隆型和VJ基因使用比较

新冠患者与不同病毒感染样本间的差异VJ对具有不一致性，仅有几个共有的VJ对。对所有的克隆性TCR比较αβ VJ对（图4a），发现不同病毒感染样本间共享的αβVJ对很少，其中，新冠与其他样本的共享率为0.46%（图4b），组合TRAV12-2-J27-TRBV7-9-J2-3也同样是COVID-19使用频率最高的特异性αβ VJ对，代表着最高的TCR克隆扩增，在新冠中可能有重要作用（图4c）。

图4 新冠患者和其他病毒感染样本αβVJ对使用比较