2021年4月15日，美国西北大学范伯格医学院联合宾夕法尼亚州立大学医学院研究团队以“Subtype-associated epigenomic landscape and 3D genome structure in bladder cancer”为题的研究论文发表于期刊Genome Biology。该研究确定了管腔和基底膀胱癌的独特表观基因组特征和3D基因组结构，并提出了转录因子NPAS2与临床膀胱癌亚型之间的新型联系。

图1 文章信息

该研究通过RNA-seq、H3K27ac的ChIP-seq、ATAC-seq和Hi-C测序方案，得到四个BLCA细胞系（两个乳头状管腔型RT4和SW780，两个基底-鳞状型SCABER和HT1376）和五个肌肉浸润性肿瘤患者样本的综合表观基因组学分析。

图2 研究方案

2个管腔型和2个基底型的RNA-seq和ChIP-seq(H3K27ac)结果显示，转录水平的差异基因表达与表观基因组水平的远端增强子活性有关，它们在BLCA的管腔亚型和基底亚型中都有显著特征。

图3 两种BLCA的转录表达差异与表观遗传水平上独特启动子和远端增强子活性有关

两个管腔型和两个基底型的ATAC-seq分析发现，每个细胞系都有32000个染色质开放区域， CTCF和AP-1复合物的结合位点在四个细胞系中都显著富集，但是两种细胞系富集有不同转录因子结合的motifs，研究人员进一步分析管腔、基底-鳞状细胞中所有富集的TF motifs和远端增强子，得到BLCA亚型和转录因子之间的关系，惊讶地发现腔型细胞中“先锋因子”forkhead TFs和GATA TFs的motifs在四个细胞系中呈富集状态，考虑到FOXA1和GATA3在基底型膀胱癌细胞系和肿瘤中是低表达的，这说明了先锋因子的补偿效应，同时作者推测腔型特异性TFs可能已经处于与这些开放染色质结合的准备状态。

图4 腔型和基底型BLCA中转录因子motif分析

研究人员假设转录因子（例如FOXA1和GATA3）通过结合染色质开放区域刺激管腔增强子并激活相关的基因表达，RT4（腔）细胞系中GATA3蛋白的ChIP-seq和已有的FOXA1蛋白的ChIP-seq分析证实了这一推测。随后，对这些远端增强子位点近端基因进行GO term分析，结果表明GATA3和FOXA1转录因子强烈参与了细胞命运和管腔分化。为了证实上述结果的医学意义，研究人员将四种BLCA细胞系与TCGA肌层浸润性膀胱肿瘤的ATAC-Seq数据进行了比较，观察到细胞系中的开放染色质区域与患者肿瘤样本具有相似的模式。

图5 BLCA细胞系的全基因组开放染色质状态与TCGA膀胱肿瘤相似

该研究不仅确定了FOXA1和GATA3在腔型和基底型BLCA中的转录组、增强子景观和转录因子结合谱，还在四个BCLA细胞系和五个肿瘤样本中首次使用Hi-C得到了全基因组染色质互作图。

作者使用自主开发的Peakachu（基于机器学习的染色质环检测软件）进行聚合峰分析得到亚型特定的染色质环，观察到四个细胞系和五个肿瘤患者之间有约30–40%相同的腔型染色质环和基底型染色质环。之后，作者关联分析了增强子和启动子环与亚型特异性基因表达，在增强子-启动子环锚处发现了FOXA1和GATA3结合位点的大量富集，表明这些先锋因子参与了3D基因组的调控。

图6 RT4（腔型）细胞中FOXA1和GATA3结合位点在环锚点富集

大的结构变异（SV）是癌症发生的重要标志，同时SV会导致3D基因组结构改变，包括新的拓扑相关域（neo-TADs）和由此产生的“增强子劫持（enhancer hijacking ）”。研究人员采用HiNT和Hi-Cbreakfinder软件分析Hi-C数据中基因组结构变异情况，观察到了有趣的增强子劫持事件和neo-TADs的形成，这为进一步研究在膀胱癌中重新排列的增强子的功能提供了重要资源。

图7 SV引起的染色质互作

最后，研究人员在腔型相关、基底型相关和共享的开放染色质区域的motif分析中观察到一种差异富集的碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白质NPAS2，作者通过最新的ENCODE数据分析表明NPAS2可能是FOXA1的上游调节子，同时使用TCGA数据分析显示NPAS2的高表达水平与患者总体生存率显著相关。在 SCABER（基底-鳞状）细胞系中进行细胞迁移实验和RT-qPCR实验，发现NPAS2过表达抑制了细胞迁移以及基底型标记基因的表达。同时，研究人员还在FOXA1和GATA3过表达的基底/鳞状BLCA细胞系中发现了NPAS2的表达，综上，作者提出了NPAS2与临床膀胱癌亚型之间的新型联系。

图8 NPAS2过表达、FOXA1和GATA3过表达的RT-qPCR分析

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