近日，bioRxiv在线发表了题为LeafGo: Leaf to Genome, a quick workflow to produce high-quality De novo genomes with Third Generation Sequencing technology的研究论文，该研究介绍了一种植物长读长测序的框架体系“LeafGo”，将高质量（HMW）的DNA与HiFi测序、Hifiasm组装相结合，7天内完成了两种桉树染色体水平基因组的组装（包含提取、文库制备、测序、组装），从而证明了“HiFi+Hifiasm”在植物从叶片到基因组中的高效性、准确性和重要性。

图1  文章发表信息

如图2所示，LeafGo流程以7天为一个周期，包含植物叶片预处理、DNA提取、文库制备、上机测序、基因组组装等。其中，HMW DNA的提取需要1天，文库制备需要1-3天，测序与组装需要3天。

图2  LeafGo流程

在DNA提取阶段，研究者随机选取7种植物，先进行黑暗预处理，再用改良的Qiagen Genomic protocol方法提取DNA，并从实验人员、操作时间等角度评估此提取方法的准确性，结果均能提取到HMW DNA。

(https://www.protocols.io/view/workflow-for-generating-hmw-plant-dna-for-third-ge-bafmibk6)

图3  LeafGo流程中HMW DNA的提取方法

三代测序技术包括CLR、HiFi、ONT等，为选择最合适的测序方法来用于LeafGo流程，研究者对两种桉树（野桉、赤桉）分别构建CLR、HiFi与ONT文库，随后分别在Sequel 、Sequel II 、 GridION进行上机测序。结果表明，Sequel的CLR平均产出11.5G/cell，读长36.6Kb；Sequel II的CLR平均产出167.6G/cell，读长36.4Kb；Sequel II的HiFi平均产出22.2 G/cell，读长19.8 Kb；ONT的平均读长41.4Kb。经过数据质控，研究者最后对CLR与HiFi 的桉树样本数据分别进行了组装（表1）。

表1  两种桉树样本CLR与HiFi组装结果的统计

由表中可看出，对于同一样本来说，与CLR相比，HiFi组装的Contig数目更少、N50更长、最长的Contig更大，其中赤桉HiFi组装的Contig N50达到了18.9Mb；BUSCO评估表明，HiFi组装的基因组完整性超过97%，大于CLR的93%。综上，在LeafGo流程中，选择HiFi测序，可以得到连续性更好、准确性更高的基因组。

为进一步体现出HiFi+Hifiasm的技术优势，研究者随后又从“染色体构建”、“计算资源消耗”等两个方面来阐述HiFi组装基因组的特点。

（1）基于HiFi+Hifiasm组装的两份桉树基因组，几乎都达到了染色体级别。具体来说，赤桉组装出了9条完整的染色体，还有两条染色体仅由2条Contig连接而成；野桉组装出了5条完整的染色体，其余的染色体仅由3-4条Contig连接而成，且赤桉与野桉与已发表的巨桉基因组具有良好的共线性。这表明，HiFi组装可以显著降低Hi-C等辅助构建染色体技术的周期与难度。

图4  HiFi组装的野桉基因组与巨桉间的共线性分析

（2）由表2可知，组装桉树基因组，HiFi+Hifiasm运行时长最快仅需1.2h，消耗的CPU时长最低仅需1404h，仅为基于CLR+Canu的6%和1.9%，这表明HiFi+Hifiasm运行时间快，计算资源消耗少。

表2  不同测序模式下桉树基因组组装消耗IT资源比对