琼脂酶降解琼脂来生产低聚琼脂糖具有许多优点和良好的应用前景。在该研究中，从南海的一种红藻中分离出一株新的琼脂降解菌弧菌Vibrio sp.A8。采用全基因组测序，结合比较基因组学和分泌组学分析，更好地了解其琼脂降解的遗传成分。经优化培养后，该菌株在人工海水中具有较好的琼脂酶产量。该株全基因组(4.88Mb)由两条环状染色体(3.19和1.69Mb)组成，分别含有4572个蛋白编码基因、108个tRNA基因和31个rRNA基因。分泌组学分析表明，只有β-琼脂酶(基因3152)在Vibrio sp的分泌体中大量表达。该琼脂酶具有良好的底物专一性和在复杂环境下的广泛工作条件，在琼脂糖寡糖生产中具有潜在的应用前景。
背景
琼脂是一种从红藻中提取的海洋多糖，广泛应用于食品工业、制药工业和生物工程，琼脂糖为琼脂的主要成分。琼脂低聚糖，包括AOS和新琼脂低聚糖(NAOS)，是琼脂糖降解产物，表现出各种生理功能，如抗氧化剂、抗炎活性、美白作用、免疫调节以及抗肿瘤活性。琼脂酶的开发在琼脂糖-低聚糖的工业化生产中具有重要意义。
到目前为止，NCBI数据库，只完成了三个V. fluvialis的基因组测序项目。然而，根据基因序列和注释数据，在这些基因组中没有发现琼脂酶基因。因此，研究弧菌是否具有一定的生物活性具有重要的意义。本研究提供了弧菌新型琼脂酶的相关信息，填补了该属琼脂降解菌的基因组信息和分类地位的空白，对更好地了解红藻表面生物膜中琼脂降解途径以及琼脂酶在生产琼脂低聚糖方面的生物技术应用具有一定的参考价值。
菌株A8的分离及生化鉴定：
琼脂酶生产条件的优化
全基因组测序、组装和注释
比较基因组分析
分泌组分析
琼脂酶的纯化及其性质
测序技术：PacBioRS II SMRT；Illumina HiSeq×Ten；
样本：红藻分离弧菌A8
1.菌株A8产琼脂酶条件的优化
当将葡萄糖，半乳糖，蔗糖或琼脂单独添加到培养基中时，在琼脂存在下琼脂酶活性最高（图1A）。如图1B，C所示，随着琼脂或半乳糖浓度的增加，培养基中的琼脂酶活性首先增加，然后降低。最佳琼脂和半乳糖浓度分别为0.2％和0.3％。在各种酵母提取物粉末浓度（0.1-0.5％）下，琼脂酶活性无显着差异（图1E）。0.5％NaCl可改善琼脂酶活性。不同的pH值对培养基中的琼脂酶活性有很大影响（图1G）。最佳pH为6.0，琼脂酶活性为12.35 U / mL。与pH值相似，培养温度对菌株A8的琼脂酶产生有显着影响（图1H）。最佳培养温度为25℃。菌株A8的生长与琼脂酶活性显着相关（p <0.01），表明菌株生长对琼脂酶生产有积极影响。菌株A8最佳培养基为人造海水中的0.2％琼脂，0.3％半乳糖，0.3％酵母提取物粉末和0.5％NaCl，最佳培养温度为25°C，pH6.0和24 h的孵育时间。在这些条件下，发酵液的琼脂酶活性为22.28 U / mL，比优化前提高了314％。
图1 不同培养条件下琼脂酶活性
2.菌株A8的基因组特征
菌A8基因组大小为4882,363bp（49.81%G+C），由Chr1（3,190,163bp，49.89%G+C）（图2A）和Chr2（1,692,200bp，49.67%G+C）两条环形染色体（图2B）组成，未检测到质粒。基因组包含4572个蛋白质编码基因，108个tRNA基因和31个rRNA基因，全部rRNA基因位于Chr1。
图2 菌株A8染色体圈图
3.菌株A8的鉴定
对A8菌株与20株弧菌相似菌株进行了比较基因组分析，在21株弧菌中，发现了1419个同源基因，构建了核心基因组(图3A)。根据核心同源基因组构建基因组系统树(图3B)。菌株A8与河弧菌ATCC 33809、河弧菌12605和河弧菌AK1296-A2-1聚在一起，表明这4株菌可能具有相似的生物学特性。在VITEK 2 GN系统上对菌株A8进行生化鉴定和特性观察。菌株A8被鉴定为河弧菌，概率为90%。根据以上结果，菌株A8可确定为河弧菌，并更名为河弧菌A8（Vibrio fluvialis A8），ANI相似性分析也证明菌株A8属于Vibrio fluvialis。
图3 比较基因组分析
4.河流弧菌A8菌株琼脂降解相关基因
河弧菌A8基因组共有112个编码CAZymes的基因(表1)。该菌株具有很高的碳水化合物降解酶，特别是GHS(48个基因)，可以水解各种多糖，包括琼脂、琼脂低聚糖、淀粉、纤维素、半纤维素和甲壳素。在河流弧菌A8基因组中发现了4个编码β-琼脂酶的基因，均属于GH50家族。河弧菌A8丰富的琼脂酶、NAOS水解酶和半乳糖苷酶基因为红藻琼脂糖化提供了巨大的优势，可作为生产可发酵糖的生物质原料。
为了研究与河弧菌A8亲缘关系密切的菌株是否具有共同的琼脂降解能力，对这些菌株的琼脂降解基因进行了比较基因组分析(表4)。有趣的是，虽然这些弧菌显示了半乳糖苷酶的编码基因，但在所有其他供试菌株中都没有观察到琼脂酶和Na_2水解酶的同源基因。这些基因可能来自创伤弧菌的水平基因转移。
总结
作者通过对新型琼脂降解菌Vibrio sp. A8 的全基因组测序，进而研究与琼脂降解相关的遗传机制。Vibrio sp. A8基因组大小为4.88Mb，包含两条环状染色体(3.19和1.69Mb)，无质粒。与同类菌株不同，Vibrio sp. A8具有独特的琼脂降解能力，其4个β-琼脂酶(GH50)和1个α-1，3-L-Na_2水解酶(GH117)由于基因水平转移而具有独特的降解能力。分泌组分析表明，只有由Gene3152编码的β-琼脂酶在细胞外表达。该琼脂酶具有良好的底物专一性和在复杂环境中的稳定性，在琼脂糖寡糖生产中具有潜在的应用前景。
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参考文献：
Li C, Li C, Li L, et al. Comparative Genomic and Secretomic Analysis Provide Insights Into Unique Agar Degradation Function of Marine Bacterium Vibrio fluvialis A8 Through Horizontal Gene Transfer[J]. Frontiers in microbiology, 2020, 11: 1934.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01934
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