环境微生物是自然界中分布最广、种类最多、数量最大的生物类群。目前宏基因组研究主要是通过二代测序，随着新一代高通量测序技术的发展，三代PacBio测序运用越来越广泛。

        与二代测序方法相比，三代宏基因组采用PacBio SMRT测序的长读长可以减少部分拼接错误，提高基因组组装准确性和微生物群落鉴定的分辨率。以下为大家分享两篇三代宏基因组文献。

文献解读一

        Comparative metagenome-assembled genome analysis of Lachnovaginosum genomospecies, formerly known as BVAB1

        Lachnovaginosum基因种的宏基因组组装基因组比较分析

        发表日期：2019年6月

        期刊：bioRxiv

        背景简介

        细菌性阴道炎（bacterial vaginosis，bv）是由于正常阴道菌群被大量大厌氧菌、阴道加德纳尔菌和人型支原体所取代而引起的一种临床综合症。细菌性阴道炎相关细菌1（bvab1）是一种在人阴道中发现的未培养细菌，属于梭状芽胞杆菌科的一个家族。细菌性阴道炎可以造成不孕、影响胎儿发育、诱发其他疾病等危害。到目前为止，还没有bvab1的基因组，这使得人们很难研究疾病相关特征。作者建议根据系统发育分析将bvab1重命名为Lachnovaginosum，并提供基因组证据，证明该物种可能代谢D-乳酸，产生三甲胺（bv相关气味的化学物质），并具有运动性。这些基因组将是一种宝贵的资源，有助于我们了解细菌性阴道病的病因异质性。

         1.研究对象

         细菌性阴道炎患者阴道灌洗液和拭子

        2.测序方法

        （1）Illumina HiSeq 4000 PE150测序

        （2）PacBio Sequell II测序，构建5kb文库

        3. 结果

        （1）PacBio平台与Illumina平台测序组装结果比较分析

        a.   三代测序技术减少了组装出细菌基因组的contig数量

        b.   基因组注释显示参考宏基因组组装基因组(MAG)中存在四个完整的rRNA操纵子拷贝。基于Illumina测序只检测到部分rRNA操纵子。

表1 MAG特征（Reference MAG 使用PacBio Sequel II平台）

        （2）利用全长16S rRNA基因进行系统发育分析，显示bvab1属于梭状芽孢杆菌科，梭形芽孢杆菌和bvab1亲缘关系最接近（图1，表2）。

表2 lachnovaginosum基因组间同源性分析

        （3）Lachnovaginosum基因组特异特征

图2 Lachnovaginosum基因组比较

图3 Lachnovaginosum基因组特征

        在参考基因组和6个MAG基因组特征（图2和3）。

        a.  在所有的MAG中都发现了编码甘露糖、果糖和L-抗坏血酸转运体的基因，以及一个D-乳酸脱氢酶基因。

        b.  在所有宏基因组中鉴定到鞭毛装配所需的全套基因，以及接受趋化作用的甲基和介导鞭毛反应的下游信号过程所需的基因。

        c.  肉眼无法观察到Lachnovaginosum的鞭毛，表明Lachnovaginosum和宿主组织之间的直接相互作用（图5）。

        d.  在所有基因组中都发现了胆碱转运子和cutc和cutd基因，但是，在参考mag中没有cutd基因。cut基因代谢胆碱并产生三甲胺（trimethylamine，TMA）。这是一种被认为在细菌性阴道炎症与鱼腥味有关的物质。这些样品的代谢组分中，TMA的丰度高于乳酸杆菌或阴道加德纳杆菌为主的群落（CST I和CST IV-B）（图4）。

图4 化学物质的代谢特征（阴道群落状态类型（CST）IV-A（Lachnovaginosum相对高丰度）、CST I（以乳酸杆菌为主）和CST IV-B（阴道加德纳菌））

图5 样品革兰氏染色照片

结   论

        本文提供了一组Lachnovaginosum基因组，前称为bvab1，是细菌性阴道炎患者阴道微生物群落的重要成员。由于该微生物无法培养，通过16S rRNA基因序列的一小部分区域检测该生物体，人们对其对阴道微生物群的贡献和对生殖健康的影响了解有限。本研究证明，这种微生物在环境中响应营养信号，使用外排系统抵抗抗生素，并与细菌性阴道炎的鱼腥气味特征有关。有必要进一步研究Lachnovaginosum基因组特征，确定其在阴道微生物群中的作用。

文献解读二

        Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-MolecuLe Sequencing

        单分子测序解决人类皮肤宏基因组复杂性难题

        通过使用PacBio测序平台，作者从皮肤宏基因组数据中构建了新菌株（拟杆菌，Corynebacteriumsimulans）及其噬菌体的高质量、完整的基因组图谱。

        1.研究材料

        皮肤表面微生物群落，选择健康女性的臂部和足部进行取样

        2.测序策略

        PacBio RS II宏基因组测序，构建10Kb文库

        Illumina HiSeq 2000 PE100测序

        Roche 454进行16s/ITS测序，分别测定16s V1-V3区和ITS1区

        3.研究结果

        （1）PacBio RS II产生了26 Mb（手部）和622 Mb（足部）的数据；Illumina Hiseq双端测序（PE100）共产生了805 Mb（手部）和3.04 Gb（足部）的测序数据。

        （2）PacBio测序量看似较少，但是已经足以从人的皮肤菌群样本中组装、注释、构建获得一例此前未知微生物（Corynebacteriumsimulans及其相应的噬菌体）的高质量基因组。

        （3）三代测序技术显著减少了Contig的数量，大大降低了序列拼接和基因组组装的难度；并且仅仅采用少量三代测序的长片段序列，就能极大地提升二代短片段测序数据的拼接组装效果，显著改善二代测序数据拼接碎片化严重的问题。

        （4）结果表明，低深度的SMRT测序数据能够准确地区分复杂群落的分类丰度，而高深度的SMRT测序数据则可以构建高质量闭合微生物图谱。

结  论

        （1）利用三代测序技术可以节约后期数据处理（如组装、拼接）的难度和时间成本；

        （2）利用二代测序的大数据量，可以对组装得到的contig甚至全基因组的丰度进行精确统计比较。

图1 PacBio测序显著降低宏基因组序列拼接难度

        综合上述两篇文章，PacBio测序技术可以显著减少contig数，降低宏基因组组装难度，缩短周期，获得更完整的基因组信息。

菲沙基因具备最新PacBio 测序平台，可提供三代宏基因组测序全套服务

        （1）提供全面和高质量的基因组解析结果；

        （2）拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，实验周期短，保证高质量的数据；

        （3）拥有多种三代测序平台和强大的计算机资源，提供最佳的测序解决方案和快速的分析平台。

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        参考文献：

        [1]Johanna B. Holm, Michael France, et al. Comparative metagenome-assembled genome analysis of Lachnovaginosum genomospecies, formerly known as BVAB1.bioRxiv,2019

        [2]Tsai Y C, Conlan S, Deming C, et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-MolecuLe Sequencing. mBio, 2016

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