呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus）是一种RNA病毒，属副粘液病毒科，经空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和6 个月以内的婴儿。潜伏期3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。
呼吸道感染是全球发病率与死亡率的主要原因，2015年，因呼吸道合胞病毒（RSV）引起的急性呼吸道感染（ALRI）导致5岁以下的儿童约3310万次疾病发作，320万次住院，11.82万例死亡。在RSV病例中，病毒感染与继发性细菌感染有很大的关联，虽然这一共同发病机制尚不清晰，但已有体外研究表明，呼吸道上皮细胞的RSV感染有助于细菌的粘附增加。临床研究表明，RSV感染儿童上呼吸道微生物群对流感嗜血杆菌和链球菌有显著的富集作用。
到目前为止，还没有研究证实RSV在呼吸道复制引起的免疫反应是否同时具有抗菌活性，目的是抑制病毒感染引起的细菌富集定植。5月17日NC上发表的文章《Airway response to respiratory syncytial virus has incidental antibacterial effects》就此进行了研究。报告同时分析有和没有呼吸道合胞病毒（RSV）感染的婴儿和儿童的上呼吸道蛋白质组和微生物群，以确定对呼吸道合胞病毒感染的先天免疫应答是否具有抗菌活性。研究发现RSV感染后的局部气道具有强的中性粒细胞反应，具有直接的抗菌作用。
测序方案
细菌16S V3-V4区， Illumina 测序
结 果
1、研究人群的特征
对84例感染（n=40）和未感染（n=44）RSV儿童的鼻咽拭子和口咽拭子进行分析。研究人群特征见表1。在RSV阳性组中，只有实验室诊断为RSV阳性且其他常见呼吸道病毒和肺炎支原体阴性的儿童纳入分析，而RSV阴性组包括RSV阴性的儿童和其他呼吸道疾病的感染的儿童。两组研究结果相吻合，临床和人体测量方法无统计学差异。在抽样前两周内未服用抗生素的儿童才会被纳入研究。
表1 研究参与者的临床和人体测量特征比较
2、上呼吸道以链球菌群为主
16S rRNA细菌V3-V4区的测序共产生6622832个高质量resdas。呼吸道微生物群丰度前10的菌群是链球菌、韦氏菌、嗜血杆菌、普雷沃氏菌、奈瑟菌、大肠杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌、莫拉西拉菌和瘦肉杆菌（图1a）。链球菌是最丰富的菌群，同时使用质谱法进行的细菌蛋白组分析显示出相似的微生物多样性特征，同样是链球菌蛋白为主（图1b）。对基因组微生物群数据进行进一步分析，以确定呼吸道RSV的复制是否对含量最高的细菌（链球菌）产生影响。在一组RSV感染儿童（n=10）中计算RSV感染前后的链球菌丰度变化，这些儿童在入院时（急性样本）和大约1个月后（恢复期样本）收集了鼻腔样本。70%的儿童（7/10），急性感染时的链球菌丰度高于康复期，而3名儿童（3/10），康复期的链球菌丰度与急性感染相比没有差异（图1c）。
图1 呼吸道微生物组成
3、RSV感染导致呼吸道中性粒细胞脱粒
为了描述RSV感染后局部呼吸道的生物通路，比较了RSV感染儿童和无RSV感染儿童呼吸道蛋白的平均表达水平。在这些表达蛋白中，有73个蛋白在RSV感染的儿童中显著高表达(图2)。对这些表达蛋白的富集分析表明，中性粒细胞脱粒途径是RSV感染儿童中最显著的生物富集过程(图2b)。RSV感染儿童呼吸道中蛋白溶解等其他途径也显著富集，但各自的富集分数远低于中性粒细胞脱粒途径(图2b)。中性粒细胞脱粒途径包括33种蛋白质——包括杀菌蛋白，它们通常定位于中性粒细胞，如MPO、AZU1、BPI、LCN2等(图2d)。除中性粒细胞蛋白外，研究还观察到RSV感染儿童其他强效抗菌蛋白的表达升高，RSV感染儿童嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPX)和Ras相关蛋白(RAP1B)的平均表达水平明显高于RSV阴性对照(图2d)。
图2 质谱分析呼吸道蛋白组
4、受感染儿童的呼吸道分泌物抑制微生物生长
由于RSV感染儿童呼吸道分泌物中抗菌蛋白的显著过表达，推断与未感染的儿童相比具有更大的抗菌活性。接着研究人员开发了一种体外检测方法来测量对常见的鼻咽癌致病菌肺炎链球菌的抑制活性。在有RSV感染的儿童和没有RSV感染的儿童的鼻腔样本中检测抗肺炎球菌活性，数据显示为细菌抑制指数(BII)，其值范围从0(无抑制)到40960(完全抑制)(图3a)。将儿童分为5个BII层(BII: 20、40、80、160、320)，并在确定每组不同OTUs的相对比例。链球菌比例随BII的增加而降低。
图3 呼吸道分泌物细菌抑制活性分析
分析在细菌抑制试验中测定的抗肺炎球菌活性与RSV感染儿童明显过表达的15个中性粒细胞蛋白的表达水平之间的相关性(图3d)。用中性粒细胞亚群对相关性进行分层分析(图3c)，观察到所有中性粒细胞颗粒蛋白的表达水平与肺炎球菌抑制活性显著正相关（图3c）。
比较了RSV-阳性和RSV-阴性儿童的肺炎球菌抑制活性。与RSV-阴性儿童相比，RSV-感染儿童呼吸道分泌物的抑菌活性显著提高(BII几何平均值:52)(BII几何平均值:10.9)(图3d)。与一个月后恢复期收集的样本相比，在感染时采集的呼吸道分泌物具有明显的细菌抑制活性。
5、RSV感染与嗜中性粒细胞增多有关
使用流式细胞法来测量呼吸道中的性粒细胞，它们是蛋白质组学分析中识别出的中性粒细胞蛋白的来源。另外还使用流式细胞术来评估这些细胞在RSV阳性和RSV阴性儿童中的功能活性。在RSV感染的儿童中，中性粒细胞的中位频率为12%，而在RSV阴性儿童中，中性粒细胞占上呼吸道细胞的8%(图4g)。虽然RSV阳性儿童呼吸道中性粒细胞的平均频率高于RSV-阴性儿童，但无统计学差异。虽然没有统计学意义，但与RSV-阴性儿童相比，RSV-阳性儿童的呼吸道中性粒细胞的吞噬活性(中位数18%)明显高于RSV-阴性儿童(中位数16%)。
图4 流式细胞法分析呼吸道蛋白组的细胞来源
6、脱粒与低氧饱和度有关
为了确定呼吸道中性粒细胞蛋白在RSV发病中的潜在作用，研究了不同蛋白表达水平对RSV疾病严重程度相关临床参数的影响。由于严重RSV肺炎特征之一是由于小呼吸道阻塞坏死、病毒感染细胞和浸润免疫细胞而导致的血氧饱和度降低。因此，研究了中性粒细胞蛋白增加表达对血氧饱和度的影响。根据不同蛋白的中位表达水平，将儿童分为两组(高中性粒细胞和低中性粒细胞表达物)。蛋白质表达水平高于中位表达水平(全部研究人群)的儿童被归类为高表达量，低于中位表达量的儿童被归类为低表达量(图5)，然后比较两组之间的氧饱和度水平。对于所有被分析的中性粒细胞蛋白(ITGAM、BPI、LCN2、MGAM、ITGB2、AZU1、ANPEP、MMP9、MPO)，与高表达组儿童相比，呼吸道中性粒细胞表达水平较低的儿童血液氧饱和度明显较高(图5a)。为了进行比较，使用中位数二分法测定了两种蛋白的表达水平- - -actin (ACTB)和b -2-微球蛋白(B2M)。与中性粒细胞蛋白相比，ACTB和B2M高、低表达物的血氧饱和度无差异(图5b)。
图5 呼吸道中性粒细胞表达与疾病严重程度的关系
1、婴幼儿RSV感染与继发性细菌感染风险增加有关，如中耳炎，主要是继发性链球菌感染；
2、儿童的上呼吸道由高度多样化的共生菌群所主导，在呼吸道蛋白组中可以检测到多种细菌蛋白；
3、在RSV感染后，大量与先天免疫相关的蛋白质的表达水平显著增加，由于RSV复制和RSV介导的细菌增加同时发生，因此无法确定这种反应的哪些直接归因于病毒，哪些因素是由细菌增加引起的；
4、急性RSV感染时的呼吸道当病毒复制达到峰值时，有利于增加细菌的定植，只要病毒感染仍未得到解决，这些条件就会持续存在。
5、在RSV感染的儿童中，发现中性粒细胞去肉芽组织途径显著丰富，其特征是中性粒细胞有效蛋白(如MPO、AZU1和ELANE)的表达增加，这些蛋白在之前的研究中已被证明与RSV感染相关；
6、与RSV-阴性儿童相比，RSV感染儿童的气道分泌物具有明显较高的抑菌活性，细菌抑制活性的增加与上呼吸道微生物的组成变化有关，其特征是链球菌丰度降低。
7、呼吸道中性粒细胞蛋白的表达增加与氧饱和度降低有关，中性粒细胞流入气道及其随后的脱粒可能在RSV疾病的病理中发挥重要作用。这些浸润的中性粒细胞可能会阻塞婴儿的小气道，导致气体交换受损，临床表现为降低血氧饱和度和缺氧。
配图来源网络/侵删
参考文献：
Charles JS , James MN , et al . Airway response to respiratory syncytial virus has incidental antibacterial effects. Nature Communications . 2019.05.17
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