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重磅项目文章 | 北京大学第三医院魏蕊/洪天配团队揭示乳酸化修饰调控胰腺导管腺癌发生发展的机制

发布时间:2024-5-13 10:07:06阅读次数: 分享到:

胰腺癌,其中约80%为胰腺导管腺癌(PDAC)。PDAC位居中国居民恶性肿瘤相关死亡率第六位,其五年生存率不足10%,预后极差。尽管过去十年间尝试治疗改进,PDAC的死亡率仍未得到明显改善,因此迫切需要深入了解PDAC发病机制,以寻找新的疾病治疗靶点。另一方面,糖酵解增强和乳酸积累在多种癌症中常见,但代谢重编程如何重塑表观遗传改变,特别是乳酸化在PDAC中的具体作用,仍不清楚。2024年5月6日,北京大学第三医院(北医三院)魏蕊研究员/洪天配教授团队在国际知名期刊Molecular Cancer(IF:37.3)发表题为“Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究成果。该研究旨在探讨乳酸化修饰调控胰腺导管腺癌发生发展的机制,特别是H3K18乳酸化(H3K18la)。结果显示,PDAC肿瘤微环境中的乳酸积累促进了组蛋白的乳酸化,且与肿瘤发生和不良临床结果密切相关。对于其机制进一步分析,研究发现,在PDAC中,增强的糖酵解导致乳酸产生增多,进而增加了H3K18la水平。这种乳酸化促进了两个细胞周期相关基因的转录——TTK和BUB1B。同时,TTK和BUB1B的表达增加又上调了P300(组蛋白乳酸化酶),而且TTK激活乳酸脱氢酶A(LDHA),增强其活性,进一步增加乳酸产生,促进组蛋白乳酸化。糖酵解-H3K18la-TTK/BUB1B的正反馈环路参与胰腺导管腺癌发生发展过程。该研究首次揭示了组蛋白乳酸化,特别是H3K18la在PDAC中的重要作用,并为PDAC辅助治疗提供了潜在的新策略。菲沙基因承担了本研究中的CUT&Tag和RNA-seq相关工作。

文章信息


研究思路

1. 研究材料:胰腺导管腺癌患者组织和胰腺导管腺癌细胞系(MIA PaCa-2、PANC-1、AsPC-1、PL45)

2. 研究方法:

● Western Blot和IHC:分别在细胞层面和组织层面检测胰腺导管腺癌中组蛋白乳酸化水平

● Kaplan-Meier生存曲线:评估组蛋白乳酸化水平与患者总生存期之间的关联

● 糖酵解抑制剂和LDHA敲低:评估在体内外抑制组蛋白乳酸化对胰腺导管腺癌生长/增殖和转移/迁移的影响

● Western Blot和功能实验:鉴定PDAC中组蛋白乳酸化的“writer”和“eraser”

● CUT&Tag和RNA-seq分析:筛选H3K18la的目标基因

● ChIP-qPCR、RT-qPCR和Western Blot:通过蛋白-DNA互作、mRNA水平和蛋白质水平的分析,验证候选目标基因TTKBUB1B是否确实受到H3K18la的调控

● 敲低或过表达TTKBUB1B:评估这2个基因在胰腺导管腺癌中的作用

● 共免疫沉淀(Co-IP):鉴定TTK与LDHA之间的相互作用


研究结果

1. 组蛋白乳酸化水平升高与PDAC患者的不良预后相关

本研究通过检测胰腺导管腺癌(PDAC)患者组织和胰腺导管腺癌细胞系(MIA PaCa-2、PANC-1、AsPC-1、PL45)中的乳酸含量,发现胰腺导管腺癌中存在乳酸的大量堆积。通过血清代谢组学分析,发现222种代谢物显著差异,并且与中心碳代谢通路关联,乳酸是组蛋白乳酸化底物。利用Western Blot,研究发现PDAC患者和细胞系样本中,赖氨酸乳酸化(Pan Kla)水平升高,H3K18la表达上调。IHC染色显示H3K18la水平在PDAC中显著升高。同时,Kaplan-Meier生存曲线证实H3K18la与PDAC患者的不良预后相关。

在74个PDAC和72个旁癌组织中,PDAC中H3K18la水平显著升高(G-J),H3K18la与PDAC患者的预后不良相关(K)


2. 糖酵解途径对组蛋白乳酸化的影响及其在胰腺导管腺癌发生发展的作用

探究糖酵解途径对组蛋白乳酸化的影响,该研究进行了体外细胞实验与体内小鼠模型实验。在体外实验中,该研究采用PDAC细胞系(MIA PaCa-2和AsPC-1),使用糖酵解抑制剂(DCA、Oxamate、2-DG)以及LDHA(乳酸脱氢酶A)敲低技术,通过补充乳酸盐Nala作为对比,Western Blot分析发现,抑制剂与LDHA敲低均能降低乳酰化水平(Pan Kla, H3K18la),减少细胞增殖与迁移能力;补充乳酸(Nala)可逆此效应。在体内试验中,该研究通过皮下注射MIA PaCa-2细胞至裸鼠,建立PDAC移植模型,给予Oxamate处理,或直接皮下注射LDHA敲低的MIA PaCa-2细胞,构建PDAC模型。结果显示,Oxamate处理与LDHA敲低显著减小肿瘤体积和重量,降低乳酸水平和组蛋白乳酸化水平;同时,IHC染色和HE染色结果显示这样会抑制细胞增殖标志物Ki-67的表达,减少肝转移。

糖酵解抑制剂(A-B)和LDHA敲低(C-D)均能降低Pan Kla和H3K18la水平


3. P300与HDAC2在PDAC中分别作为组蛋白乳酸化的“writer”与“eraser”

组蛋白乙酰化酶P300被报道为潜在的组蛋白乳酰基转移酶。为了进一步探究组蛋白乳酸化的作用机制,该研究首先验证组蛋白乳酸化的“writer”-P300,然后通过多种组蛋白脱乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂筛选“eraser”。结果显示, P300敲低(si-P300)或其抑制剂(C646)处理会使得Pan Kla及H3K18la水平明显下降,同时敲减P300或抑制剂干预会抑制NaLa对乳酸化的促进作用,进一步可抑制PDAC细胞(MIA PaCa-2与AsPC-1细胞)增殖与迁移。此外,HDAC同工酶过表达显示,HDAC2显著降低乳酰化水平(H3K18la),而HDAC1、HDAC3无影响,提示HDAC2为乳酸化“eraser”。

P300敲低(si-P300)会使得Pan Kla及H3K18la水平明显下降


4. H3K18la介导PDAC中TTK和BUB1B的转录

该研究使用H3K18la抗体进行CUT&Tag实验,发现Oxamate处理能显著降低PDAC细胞转录起始位点和启动子区域H3K18la的富集水平,KEGG和GO分析则显示H3K18la在promoter区富集降低相关的基因主要位于细胞周期相关通路。通过RNA-seq分析Oxamate处理对基因表达的影响时,识别到众多与细胞周期调控相关的基因变化,KEGG和GO分析进一步确认细胞周期通路的显著富集,强调了乳酸化在细胞周期调控中的作用。结合CUT&Tag、RNA-seq数据和GEPIA数据库,该研究筛选出14个在PDAC中高表达且受H3K18la调控的基因,这些基因与细胞周期进程紧密相关。集中研究与细胞周期M期紧密相关的四个基因(CDC6, TTK, BUB1B, PTTG1),特别是对于有丝分裂过程中染色体分离很重要的TTKBUB1B。最后,利用ChIP-qPCR验证了H3K18la在TTKBUB1B启动子区的减少与糖酵解抑制剂使用相关,同时糖酵解抑制剂能下调这两基因的mRNA和蛋白水平,揭示H3K18la通过糖酵解途径调控它们的表达,影响PDAC进程。

H3K18la CUT&Tag实验(A-D, H);RNA-seq实验(E-F);ChIP-qPCR、RT-qPCR和Western Blot验证候选目标基因TTKBUB1B是否确实受到H3K18la的调控(I-K)

随后,通过多层次证实,包括细胞实验、临床样本分析、数据挖掘及生存分析,该研究系统性地确立了TTK和BUB1B高表达与PDAC恶性特征及患者预后较差之间的密切联系。其中,TTK和BUB1B在PDAC细胞中显著升高,指示其在肿瘤细胞中活性增强;IHC分析显示,PDAC肿瘤组织相比于相邻非肿瘤组织,TTK和BUB1B的表达水平有显著提升;结合GEPIA和GEO数据库的广泛样本数据,分析显示PDAC患者组织中TTK和BUB1B的表达均高于正常组织;通过GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库的分析,揭示了TTK或BUB1B高表达的PDAC患者,其总生存期和无病生存期较短于低表达患者,提示基因高表达与不良预后有关。

TTK或BUB1B高表达与不良预后关联


5. H3K18la靶基因TTK/BUB1B与糖酵解/乳酸化之间存在正反馈循环

为了评估PDAC中TTK和BUB1B的功能,该研究采用siRNA技术在PDAC细胞系(MIA PaCa-2和AsPC-1)中敲低TTK和BUB1B表达,观察到细胞活力下降和迁移能力被抑制。通过在MIA PaCa-2细胞中过表达TTK,并结合糖酵解抑制剂处理(如Oxamate和2-DG),发现尽管TTK高表达本身未显著增加细胞增殖或迁移,但其存在能减弱糖酵解抑制剂的抗癌效果。这表明TTK可能在糖酵解途径调控肿瘤进展和组蛋白H3K18乳酸化过程中具有复杂的调节作用。

TTK过表达能减弱糖酵解抑制剂的抗癌效果

BUB1B被报道在肺腺癌中的表达与细胞周期及糖酵解呈正相关,并通过影响糖酵解相关基因来促进肺癌的发展。该研究发现,敲低TTK或BUB1B能显著降低P300蛋白水平,考虑到P300是已知的组蛋白乳酸化“writer”,研究者推测在PDAC进展过程中,TTK/BUB1B不仅参与了糖酵解-组蛋白乳酸化- TTK/BUB1B的路径,还形成了对组蛋白乳酸化的正反馈。进一步探讨TTK/BUB1B对PDAC中糖酵解的影响,该研究关注糖酵解关键酶LDHA,并通过Co-IP实验证实TTK与LDHA相互作用。TTK敲低显著抑制了LDHA磷酸化状态,进一步抑制LDHA酶活性,减少乳酸产生,表明TTK通过影响LDHA调控糖酵解。最终,研究观察到TTK敲低减少了Pan kla与H3K18la水平,进一步证明TTK在糖酵解与组蛋白乳酸化之间建立了一个正反馈环路。总结而言,H3K18la靶基因TTK/BUB1B与糖酵解/乳酸化之间存在正反馈环路。

糖酵解-H3K18乳酸化-TTK/BUB1B环路参与胰腺导管腺癌发生发展的模式图


小  结

该研究综合细胞生化分析、组学技术、蛋白质互作以及功能验证等,深度揭示了乳酸代谢重编程与表观遗传学调控之间的作用模式,这对于理解PDAC的分子机制及探索潜在治疗策略具有重要意义。研究揭示,H3K18la在胰腺癌中显著增加,其高水平预示预后不良。糖酵解调控组蛋白乳酸化,影响胰腺癌进程。关键发现,H3K18la促进TTKBUB1B转录,它们是细胞周期和有丝分裂关键酶,促进肿瘤增殖。TTK、BUB1B表达增加,又反过来上调P300和激活LDHA,加强组蛋白乳酸化。简而言之,从糖酵解到组蛋白H3K18la乳酸化,再到TTK/BUB1B表达和代谢酶的增加,再到乳酸的再次积累,形成了一个正反馈环路,该环路促进肿瘤发生发展。


北京大学第三医院内分泌科博士生李菲、检验科副研究员司文喆及内分泌科博士生夏利为共同第一作者,内分泌科魏蕊研究员和洪天配教授为共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金等课题经费的支持。


参考文献

Li F, Si W, Xia L, et al. Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Molecular Cancer, 2024, 23(1): 90.

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