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助力国自然|三代全长测序技术在单细胞转录组学中的应用

发布时间:2024-3-13 11:11:48阅读次数: 分享到:

技术背景


在科技飞速发展的时代,组学领域的研究也日新月异。单细胞转录组学来在生命科学领域发挥着重要作用。单细胞转录组学可以更深入地了解单个细胞的基因表达情况,揭示不同细胞类型之间的差异,以及在发育、疾病等过程中的变化。随着长读长转录组测序技术的不断进步,单细胞转录组的研究已经不仅仅是基于基因水平的量化,基于转录异构体的表达分析细胞特异性的转录起始位点和差异转录异构体的研究也越来越多。长读测序被选为2022年的年度方法,它彻底改变了当前的生命科学和生物医学研究,为研究人员提供了无数新的机会,同时被认为是大规模单细胞组学的下一个前沿[1]。三代全长转录组测序技术与单细胞转录组学的结合也成为了当前研究的热点之一。目前,菲沙已推出基于Iso-seq+串联策略的MAS-seq测序技术,可将通量可提高16倍,详见:新产品|MAS-seq三代单细胞转录组测序分析。



应用案例


当三代全长测序技术与单细胞转录组结合时,可以研究多种生物医学问题,特别是能识别肿瘤等疾病的驱动因素的基因融合和细胞特异性的转录异构体,有助于揭示可变剪接的潜在机制。目前已广泛应用在神经发育、肿瘤发生(直肠癌,乳腺癌,肝癌,卵巢癌等)、疾病研究、免疫组学等领域。


案例一

全长转录组测序在组织和单细胞分辨率上分析人类妊娠期发育中的新皮层的生发区和皮质板区域

英文标题:Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms

人类大脑发育受到严密的分子遗传控制,其中普遍存在RNA剪接,并且与神经疾病有很强的联系。然而,并没有系统地研究细胞类型特异性剪接或转录异构体多样性在人类大脑发育中的作用。该研究利用scIso-Seq在组织和单细胞分辨率上深入分析人类妊娠期发育中的新皮层的生发区(germinal zone, GZ)和皮质板(cortical plate, CP)区域的全长转录组,以一个新的细胞特异性基因异构体表达图谱重塑了对大脑发育和疾病的理解(图1)。该研究中共鉴定到214,516个独特的转录异构体,其中72.6%是新发现的,揭示了转录异构体多样性,受RNA结合蛋白调控,定义了发育中新皮质中的细胞特征。通过对转录异构体的基因注释,重新发现数千个罕见的新发生风险变异的候选转录本,并阐明了神经精神疾病的遗传机制[2]

图1:妊娠中期发育中人类新皮层的细胞类型特异性的全长转录组


案例二

全长转录组测序揭示乳腺癌转录组可变剪接异构体的复杂性和多样性

英文标题:A comprehensive long-read isoform analysis platform and sequencing resource for breast cancer

该研究利用Iso-Seq对之前认为已经被充分研究的乳腺癌转录组进行了全长转录组测序。其队列为4个正常人类乳腺样本和26个肿瘤样本,正常样本由2个细胞系和2个正常乳腺组织组成,乳腺癌样本包括13个原发性乳腺肿瘤活检组织(3个激素阳性ER+/PR+,3个HER2+;和7个三阴性乳腺癌)、9个患者来源的异种移植(PDX)肿瘤和4个乳腺癌细胞系。利用三代全长转录组测序鉴定数千个以前未注释的异构体,约30%影响蛋白质编码外显子,并被预测为能改变蛋白质定位和功能的转录异构体,最终确定了3059个乳腺肿瘤特异性剪接事件,其中有35个与患者生存显著相关。通过三代全长单细胞转录组分析结识了乳腺癌中以前未知的剪接事件的复杂性、癌症亚型特异性和临床相关性,并为免疫肿瘤学治疗靶点提供丰富的资源。最后该作者认为:Iso-Seq特别适合发现含有肿瘤免疫新靶点的异构体。包括鉴定定位在细胞表面蛋白的isoform,针对这些isoform可以生成特异性单克隆抗体,用作治疗药物或作为嵌合抗原受体(CAR)T 细胞的骨架。同工型还产生可用于疫苗接种方案的肽,可能与免疫检查点抑制剂结合使用[3]

图2:乳腺癌的三代全长转录组研究


案例三

全长单细胞转录组测序识别卵巢癌转录本和基因组变化

英文标题:Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer

该研究通过对三名高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者的五个样本(两个癌旁样本)的临床样本进行了全长单细胞转录组测序(图3),并将PacBio测序深度提高到每个细胞12,000条reads。共鉴定到152,000个同种异构体,其中超过52,000个之前未被报道果的,充分说明长读长测序技术在探索罕见或低丰度的转录本的优越性。同时还检测到肿瘤细胞和间皮细胞中特定细胞类型的同种异构体和多腺苷酸化位点,发现在肿瘤转移过程中,部分间皮细胞向癌相关成纤维细胞转化是通过TGF-β/miR-29/胶原轴。此外,长读长测序技术还帮助检测到多个基因融合事件,包括一个经实验证实的IGF2BP2::TESPA1融合,并进一步研究了与之相关的基因组变化。可见,三代全长单细胞转录组测序在肿瘤学和个性化医学中将变得越来越重要[4]

图3:卵巢癌全长单细胞转录组研究


案例四

全长单细胞转录组测序助力生殖疾病的研究

英文标题:Long-read single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of spermatogenesis in obstructive azoospermia and Sertoli cell-only patients

该作者实验设计从OA和NOA患者的睾丸活检中分离了单个细胞,通过比较Pacbio长读长单细胞测序(OA n = 3,NOA n = 3)与短读长单细胞测序(OA n = 6,NOA n = 6)(图4),在OA和NOA患者中分别检测到了130,426个长读取转录本(其中包括100,517个新转录本和29,909个已知转录本),以及49,508个长读取转录本(包括26,002个新转录本和23,506个已知转录本)。此外,在OA和NOA患者中分别鉴定出了36,373个和1642个新基因。重要的是,在正常精子发生过程中检测到了生殖细胞和体细胞中长读长转录本的特异表达。这些发现可能为人类精子发生和男性不育的治疗提供有价值的信息[5]

图4:梗阻性无精症三代全长转录组研究



小  结


将单细胞转录组学与长读长测序技术相结合,能回答更复杂的生物医学问题,揭示更具体的事件和机制。为生命科学领域的研究带来新的突破和进展,推动领域的发展迈向一个新的高度。


参考文献:

[1] Conte M I, Fuentes-Trillo A, Conde C D. Opportunities and tradeoffs in single-cell transcriptomic technologies[J]. Trends in Genetics, 2023.

[2] Patowary A, Zhang P, Jops C, et al. Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms[J]. bioRxiv, 2023: 2023.03. 25.534016.

[3] Veiga D F T, Nesta A, Zhao Y, et al. A comprehensive long-read isoform analysis platform and sequencing resource for breast cancer[J]. Science Advances, 2022, 8(3): eabg6711.

[4] Dondi A, Lischetti U, Jacob F, et al. Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 7780.

[5] Wu X, Lu M, Yun D, et al. Long-read single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of spermatogenesis in obstructive azoospermia and Sertoli cell-only patients[J]. QJM: An International Journal of Medicine, 2024: hcae009.

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