另辟蹊径—卷热点不如找亮点
春节已过，又到了一年一度的国自然申请紧张时期了。本子该怎么写，基金才更容易中？生命科学领域的热点问题和热门技术，总是备受青睐，结果基金申请的雷同度高，淘汰率也高。与其跟风去卷热点，倒不如努力找找亮点，做到与众不同。那么该如何另辟蹊径呢？小众而不“小重”的免疫组库技术，正是风景这边独好，下面让我们一起来开启免疫组库之旅吧！
见微知著—从免疫细胞到免疫系统
免疫是由种类及功能多样的淋系和髓系免疫细胞组成的复杂系统和网络，对抵抗疾病维持健康至关重要。据最新研究，人体的免疫细胞主要包括T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞等，且广泛分布于血液、骨髓、淋巴结、皮肤、肝、肾及肺等脏器，其总数约1.8x1012个，重量约为1.2 kg（图1）[1]。其中，B、T细胞作为主要的淋系免疫细胞，是发挥获得性免疫应答的主力军。
图1.人类免疫细胞分布和数量图谱
欲善其事先利其器—免疫组库测序
B、T细胞抵抗内外抗原依赖于其表达的表面受体，即B细胞表面受体（BCR）和T细胞表面受体（TCR）。由于B、T细胞特殊的V(D)J基因的重组重排机制，BCR和TCR具有多样性高、特异性强、变异性大等特点，总量估计高达107种。免疫组库测序（Immune Repertoire Sequencing，IR-Seq）即是对BCR和TCR的mRNA分子进行特异性捕获和扩增、高通量测序以及生物信息学分析和挖掘，进而全面深刻评估机体的免疫状态，探究免疫和疾病的关系。免疫组库测序在医学科研和临床转化上均表现出巨大的潜力。菲沙基因可以提供从bulk到单细胞，从二代到三代的全方位的免疫组库测序服务，具体的产品信息见表1。
图2.BCR V(D)J基因重组重排及体细胞高频突变
表1. 菲沙基因免疫组库产品系列
事实胜于雄辩—成功案例介绍
单细胞免疫组库辅助抗体药物发现
本研究首先通过流式分选技术从I临床期受试者的PBMC中筛选与五种重组金黄色葡萄球菌（MRSA）抗原蛋白相结合的特异性记忆B细胞；随后对这些记忆B细胞进行10x单细胞BCR测序和分析，筛选到10种IgG抗体序列。随后的实验验证发现IgG-6表现出对MRSA感染有明显的治疗效果，是治疗MRSA感染新的潜力药物[2]。菲沙基因承担了本研究中的单细胞测序和数据分析工作，特别是基于自主研发的BCR序列拼接和筛选流程，从海量的BCR序列中进行高效过滤和筛选，为后续特异性抗体候选药物验证和发现奠定了坚实的基础。
图3.BCR轻重链V/J基因使用
此外，单细胞BCR/TCR结合单细胞RNA测序在神经系统疾病、自身免疫疾病、肿瘤、炎症等方向具有天然的优势，为深刻揭示从淋巴结、外周血和组织的免疫微环境提供了强大的武器。
二代TCR测序研究神经系统疾病
EBV病毒感染是多发性硬化症（MS）的风险因素之一，但是其导致MS的具体机制未知。从8例复发缓解型的MS患者取其PBMC和脑脊液（CSF），并对PBMC的细胞分别给予EBV病毒感染的自体淋巴母细胞样细胞系（LCL）、EB病毒和其他病菌刺激， 6天后分选相应的细胞。对CSF、未分选的PBMC、抗原特异性PBMC进行TCR CDR3测序。结果发现，LCL特异的TCR序列与CSF和PBMC的TCR序列有最高的重叠度；且LCL和CSF的top 1%克隆型有47%的共享率。因此，LCL诱导的克隆扩增外溢至脑脊液，可能是MS的发病的免疫学机制[3]。
转录组测序数据的免疫组库再挖掘
Bulk RNA测序以其技术成熟价格低廉而成为科研界的必配，并产生了海量数据（TCAG等）。虽然基于公共的转录组数据的再挖掘比较普遍，但仍然未突破基因表达变化这一范畴。基于大队列的RNAseq数据进行BCR或TCR分析，则关注较少，具有极大的机遇，目前已有部分成功的案例发表。一项针对HER2+乳腺癌患者的免疫微环境研究中，研究者对来自于NeoALTTO（N=254）和CALGB 4060（N=264）治疗的2项III期临床实验的治疗前的RNAseq数据进行回顾性研究，系统探索了BCR和TCR的复杂特征及组间差异[4]。在另一些基于中国人群的RNA测序脑胶质瘤队列中，对IDH野生型、IDH无1p/19q缺失（IDHmut-noncodel）和IDH有1p/19q缺失（IDHmut-codel）三个亚型，共913个样本的转录组数据进行分析，共鉴定超过32万个TCR/BCR克隆型，结果发现不同亚型间的TCR和BCR特征具有明显差异，文章还构建了第一个中国人群的脑胶质瘤的免疫组库数据库GTABdb[5]。
空间免疫组库技术
目前的空间转录技术可以实现基因表达和细胞分布的空间定位，但是仍然无法确定BCR和TCR序列的空间分布，极大了阻碍了对BCR/TCR分子功能的挖掘。为了解决这一问题，瑞典卡罗林斯卡学院的学者们开发了一种空间免疫组库测序策略，可以获取全长的BCR和TCR序列的空间位置分布信息，该研究最近发布于Science杂志。该方法在10x Visium空间转录组的基础之上，采用IG和TR特异性的引物扩增进而实现BCR和TCR转录本的富集，并同时兼容二代（TR）和三代测序（IG和TR）。该方法扩宽了空间组学的应用边界，具有广阔的前景[6]。
图4.空间BCR/TCR测序
参考文献
[1] Sender R, Weiss Y, Navon Y, et al. The total mass, number, and distribution of immune cells in the human body[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(44): e2308511120.
[2] Wang W H, Gu Y R, Ou Y X, et al. Human monoclonal antibodies against Staphylococcus aureus A protein identified by high-throughput single-cell sequencing of phase I clinical volunteers' B cells[J]. Clinical Immunology, 2023, 257: 109843.
[3] Gottlieb A, Pham H P T, Saltarrelli J G, et al. Expanded T lymphocytes in the cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients are specific for Epstein-Barr-virus-infected B cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2024, 121(3): e2315857121.
[4] Rediti M, Fernandez-Martinez A, Venet D, et al. Immunological and clinicopathological features predict HER2-positive breast cancer prognosis in the neoadjuvant NeoALTTO and CALGB 40601 randomized trials[J]. Nature communications, 2023, 14(1): 7053.
[5] Wang L, Xu Z, Zhang W, et al. Comprehensive characterization and database construction of immune repertoire in the largest Chinese glioma cohort[J]. Iscience, 2024, 27(1).
[6] Engblom C, Thrane K, Lin Q, et al. Spatial transcriptomics of B cell and T cell receptors reveals lymphocyte clonal dynamics[J]. Science, 2023, 382(6675): eadf8486.
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