单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 能够以单细胞分辨率进行转录组分析，生成单个细胞的表达谱。因此scRNA-seq可以提供细胞间基因表达的详细信息，并鉴定异质细胞群中的稀有细胞，被广泛应用于生物发育、正常组织、癌症和其他疾病的研究利用。scRNA-seq主要流程包括组织解离制备单细胞（核）悬液、文库构建、上机测序及数据分析四个步骤。以上流程中，最重要最关键的一个步骤就是单细胞悬液制备，如果单细胞悬液质量差，会直接影响单细胞转录组测序结果的可靠性。

单细胞RNA测序已被广泛用于估计异质性组织的细胞组成和获得单个细胞的转录谱。单细胞样本解离的多种方法已经被提出，现在所缺乏的是对它们的优缺点以及偏好性进行系统的比较。研究人员利用成年小鼠肾脏和10x Genomics Chromium平台，评估了两种不同组织解离方法、两种单细胞悬液保存方式和三种组织抽核方法间的优缺点，以及对数据结果的影响。从而让研究人员在进行单细胞实验时可以做出更好的选择。

每个实验使用了来自三只不同成年雄性小鼠的三个肾脏。

两种组织解离方法：

● 热解离（warm dissociation）

37℃下使用美天旎Multi-tissue dissociation kit 2进行组织解离

● 冷解离（cold dissociation）

低温活性酶在冰上进行组织解离

两种单细胞悬液保存方法：

● 甲醇固定：用80%甲醇在−20℃下固定样品，然后在−80℃下保存

● 冷冻保存：用50% FBS + 40% RPMI-1640 + 10% DMSO，梯度冷却到-80度，然后液氮储存。

三种组织抽核方法：

● 3 x 500g + 流式分选

● 1 x 2000g + 流式分选

● 蔗糖密度梯度离心

单细胞悬液制备完成后，在10x Genomics Chromium上进行了单细胞转录组测序，同时做了Bulk RNA-seq。

比较不同组织解离方法

热解离会诱导应激反应，解离后得到的细胞悬液做Bulk RNA-seq，在热解离样本中鉴定到71个上调基因，而冷解离获得的样本，只有5个基因发生上调。利用ToppGene进行基因功能分析发现热解离样本的高表达基因很多都参与调节细胞死亡。这些结果表明热解离组织会导致应激反应相关基因的变化。

比较不同单细胞悬液保存方法

接下来评估了冷冻保存和甲醇固定能否保持样本中各种细胞类型的占比和转录谱。将冷解离和热解离得到的肾脏的单细胞悬液，等分进行冷冻保存（50% FBS、40% RPMI-1640、10% DMSO）并保存 6 周，另一部分进行甲醇固定并保存 3 个月。然后使用 10x Genomics Chromium scRNA-seq 对这些存储的样本进行分析。所得数据集分别包含 11,627 个和 5545 个甲醇固定细胞以及 3519 个和 3483 个来自冷解离和热解离肾脏的冷冻保存细胞。尽管单细胞转录组测序时上了相同的细胞数，但经过质量控制和数据过滤后，从冷冻保存的样品中获得的高质量细胞数量明显低于新鲜样品和甲醇固定样品的数量（约 30%）。

肾脏中细胞最多的细胞类型是近端小管细胞(PT)，两种细胞保存方法中，PT恢复率差异最显著。在新鲜单细胞悬液中，PT在冷解离和热解离样品中分别占63.12%和70.86%。然而PT在冷冻保存的样品中占比明显下降，分别为0.31%和0.57% 。比较其他细胞类型的占比，发现在冷解离后冻存的样品中，5种细胞类型占比显著下降，其中3种细胞在热处理后冻存的样品中也不足。以上数据说明，样本在冻存和复苏过程中会对样本中细胞组成产生影响。

在冷解离的样品中，与新鲜细胞悬浮液相比，在冻存后有31个基因在至少一个细胞类型种过表达，在甲醇固定后有27个基因在至少一个细胞类型中过表达。在冻存样本中，应激反应相关基因被诱导,包括多个即刻早期基因和热休克蛋白。相比之下甲醇固定样本中高表达的是在肾小管细胞中高表达的基因以及血红蛋白基因。 这些基因在几乎所有细胞中都表达，说明甲醇固定损伤了这些细胞，释放大量游离的RNA，导致环境RNA污染。

比较单细胞转录组和单细胞核转录组测序结果

前面的结果显示冷解离方法对细胞造成的损伤较小，接下来将其与snRNA-seq 做比较。用了三种组织抽核方法。三种组织抽核方法得到的结果类似，最显著的差异是第二种方法的线粒体基因污染更高。通过比较单细胞和单细胞核转录组测序结果，发现除肾上皮细胞外，其他非上皮性肾细胞类型的检出率差异很大。在所有实验中，snRNA-seq的免疫细胞检测率0.73%低于scRNA-seq的6.03%。在snRNA-seq文库中，巨噬细胞是唯一被检测到的免疫细胞类型，而在scRNA-seq文库中，除巨噬细胞外，还检测到了T细胞（1.38%），B细胞（0.77%）和NK细胞（0.65%）。通过基因差异表达分析发现，snRNA-seq文库中长链非编码RNA（long noncoding RNA）的表达较高，而scRNA-seq结果中线粒体和核糖体功能相关基因表达较高。

综上本文有以下几点

在热解离条件下，会在某些细胞类型中诱导应激反应基因的表达，产生细胞转录水平的表达差异。冷解离能够有效的消除、降低由于热解离的转录偏差，提升数据质量，但对于某些难消化的细胞类型，解离效果不佳。组织解离的温度可以诱导转录组的变化，可以影响样品中细胞类型的组成。

解离后的肾脏细胞在冻存后会导致样本中的上皮细胞大量减少，推测样本在冻存和复苏过程中会对样本中细胞组成产生影响。甲醇固定可以更好的保持样本中各种细胞类型的占比，但会损伤细胞，造成环境RNA污染。

单细胞核转录组文库中的免疫细胞占比低于单细胞转录组文库，可能是免疫细胞在组织解离过程种更容易被解离造成的。