图1  文章发表信息

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）被认为是欧洲和北美的一种入侵物种。在中国，它是一种有经济价值的物种，也是许多沿海城市和其他地区的重要养殖产业。因其美味可口和营养价值高，而深受中国消费者的喜爱。正如在动物营养的许多领域一样，微生物群在宿主的生长、健康和生存中的作用已经成为人们感兴趣的课题。因此，对健康组织中共生微生物群的研究有助于进一步了解微生物群在螃蟹生长和健康中作用，促进对菌群潜在功能的开发利用，并且可以为疾病预防提供基础依据。

微生物群在宿主的健康和代谢中起着重要的作用，如拮抗致病菌、调节宿主免疫、参与营养吸收和维生素合成。同时，微生物群的组成结构和生理功能也受到各种外部环境、食物、宿主自身的生理状态等因素的影响。高通量测序技术与生物信息学方法相结合正在使微生物学发生革命性的变化，它们在很大程度上扩展了我们对与无脊椎动物相关的微生物生命的看法，如微生物群落组成、功能潜力和代谢活动。

（1）确定中华绒螯蟹三个部位的核心微生物群；

（2）比较健康条件下不同部位共生微生物群组成和特征的差异及其预测功能；

（3）分析中华绒螯蟹三个部位共生微生物群的相互关系。

样本采集：从当地养殖场收集了中华绒螯蟹（收集前后3个月均未见疾病症状），并进行了解剖以获得血淋巴、肝胰腺和肠道样本；

测序策略： 二代扩增子测序技术（Illumina Miseq PE300平台）。

1、不同位点细菌群落的多样性和结构

经过质控过滤筛选，从36个样本中共获得2,479,691条有效序列，平均读取长度为457 bp。Good’s覆盖率显示，样品中检测到98%以上的细菌种类，稀疏曲线趋于接近饱和平台，说明样品中大部分微生物多样性被检测到。在97%的相似性阈值下，利用alpha多样性指数评估了这三个位点的微生物复杂性。统计学分析显示，血淋巴和肝胰腺细菌群落的多样性和丰富度差异无显著差异（Welch t-test’s，p>0.05），但显著高于肠道（Welch t-test’s，p<0.01）。采用多变量统计分析，比较不同地点细菌群落的整体结构。ANOSIM结果显示，三个位点之间的细菌群落结构存在显著性差异（R=0.67，p=0.001）。PCoA将ANOSIM的结果可视化，结果显示肠道样本紧密聚集，与血淋巴和肝胰腺样本明显分离。血淋巴样本聚成两部分，肝胰腺样本较为分散。总的来说，PCoA在两个主坐标上解释了所有样本中33.58%的变异。基于OTU水平上的层次聚类树显示，肠道内的细菌群落单独聚为一个分支，肝胰腺和血淋巴样本分别聚类为多个小分支，部分样本没有完全分离。

图3  不同地点细菌群落结构分析

2、不同位点菌群组成差异分析

所有样本的序列注释为66个细菌门、199纲、505目、902科、2111属、19521个OTUs。在门水平上，变形菌门(34.74%±5.26%)在血淋巴中相对丰度最高，其次是厚壁菌门(15.10%±2.06%)，酸杆菌门(10.63%±2.24%)，拟杆菌门(9.35%±2.87%)，放线菌门(6.06%±1.66%)，其余门的相对丰度小于5%。肝胰腺的优势门为变形菌门(34.71%±18.42%)，其次是厚壁菌门(25.73%±16.10%)、酸杆菌门(9.23%±3.37%)、拟杆菌门(8.18%±3.84%)，其余门的相对丰度小于5%。肠道内优势门为厚壁菌门(41.37%±23.49%)，其次是变形菌门(29.50%±18.42%)、拟杆菌门(23.06%±10.61%)和酸杆菌门(1.98%±0.96%)，其余门的相对丰度小于1%。在属水平上，血淋巴中整体属的相对丰度较低(相对丰度<5%)。unclassified_norank_Bacteria、肠杆菌(Enterobacter)、norank_Vicinamibacterales和假单胞菌(Pseudomonas)的相对丰度相对较高。肝胰腺的优势属为肝原体念珠菌属(Candidatus Hepatoplasma)，其次为希瓦氏菌属(Shewanella)、气单胞菌属(Aeromonas)、肠杆菌属(Enterobacter)和肠球菌属(Enterococcus)，其余属的相对丰度较低。肠道中念珠菌杆菌(CandidatusBacilloplasma)原生质相对丰度最高，其次是未分类的阿尔法变形菌门(unclassified_Alphaproteobacteria)、玫瑰杆菌(Roseimarinus)、弧菌(Vibrio)、异常单胞菌(Dysgonomonas)和不动杆菌(Acinetobacter)。

图4  所有36个样本在门水平上的细菌群落分布

3、不同位点菌群组成差异分析

基于属水平，对12只蟹的微生物群进行了花瓣图分析。结果显示，血淋巴和肝胰腺共有属为226个，血淋巴和肠共有属为187个，肝胰腺和肠共有属为204个，三个部位共有属为177个。12只蟹各部位的花瓣图分析显示，血淋巴有1616个属，其中共有属为279个，占比17.26%；肝胰腺有1919个属，其中共有属305个，占比15.83%；肠道有1443个属，其中共有属219个，占比15.18%。

通过LEfSe进一步分析了在不同部位存的差异OTUs。LEfSe在三个位点中发现了24个差异OTUs，其中9个差异OTUs在肠道中显著富集，8个差异OTUs在肝胰腺中显著富集，7个差异OTUs在血淋巴中显著富集。Shewanella_OTU13154、Pedobacter_OTU17557和Nitrospira_OTU7539在肝胰腺中显著富集。肠道中显著富集的OTUs均来自变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，其中来自Firmicutes的Candidatus Bacilloplasma_OTU10971最为丰富。血淋巴组显著富集的OTU都来自于不同的门，其中Chujaibacter_OTU1225，Acinetobacter_OTU11523来自于Proteobacteria。

图5 不同地点细菌的花瓣图及网络图

4、不同位点微生物相互作用网络分析

三组微生物网络结构差异较大，与肠道和肝胰腺相比，血淋巴微生物网络的复杂度较高。比如：血淋巴微生物网络有更多的边(36325)，更高的平均度(36.108)，更高的平均聚类系数(0.819)。肠道与肝胰腺相比虽然节点和边较少，但是有更高平均聚类系数(0.707)。我们以节点度(degree)大小作为是否为关键物种依据，结果显示，关键微生物类群主要属于细菌中的变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。进一步的分析发现网络中的属水平的关键物种，并非各位点中相对丰度较高的物种，且多数在各位点的共有属中可以发现。为评估其对网络的影响。我们删去关键类群OTU，重构了三个位点的共生网络，结果表明，如果没有关键类群的OTU，微生物网络就会变得更简单。例如，删除表S6前中的3%的潜在关键类群OTU后(血淋巴30个OTUs、肝胰腺23个OTUs、肠道5个OTUs)，网络的节点数、节点度及模块性等重要参数都有所下降。

5、细菌群落的功能预测

我们首先使用ANOSIM揭示三组之间的功能差异，结果显示,血淋巴和肝胰腺之间没有显著差异（p>0.05），而肠道和血淋巴肠道和肝胰腺之间均有显著差异（p<0.05)。进一步用Tax4Fun分析预测细菌群落的微生物功能，在KEEG2水平，血淋巴和肝胰腺在细胞生长和死亡、循环系统、心血管疾病、病毒性传染病等方面显著富集；肠道中富集的微生物功能是聚糖生物合成和代谢、信号分子和相互作用、免疫系统、运输和分解代谢以及细胞群落真核生物。基于平均邻域的功能聚类分析显示，肝胰腺和血淋巴功能聚类在一个分支，而肠道聚在另一个分支。

在KEGG 3水平，发现血淋巴中代谢、氨基酸代谢、异生物生物降解和代谢、能量代谢、萜类和多酮代谢以及氧化磷酸化等功能显著富集。肝胰腺中唯一显著富集的微生物功能是卟啉和叶绿素代谢。环境信息处理、糖聚糖生物合成和代谢、人类疾病和细菌感染性疾病在肠道中显著富集。

图6 细菌群落的功能类别热图图谱

本研究首次对中华绒螯蟹血淋巴、肝胰腺和肠道微生物群的分类和功能差异进行了全面的描述。共生菌群的结构、组成和预测功能在这些位点上有显著差异。有趣的是，与肠道和肝胰腺相比，血淋巴中菌群组成不同个体间的差异更小。健康状态下一些特异性细菌可能为监测螃蟹的健康状况提供潜在的指示。这三个部位的微生物相互作用网络差异很大，其中肝胰腺最为复杂，其次是血淋巴，肠道最简单。此外，与萜类和多酮、外来生物降解和代谢、能量代谢等代谢相关的功能途径在血淋巴中显著富集；而与环境信息处理、聚糖生物合成和代谢、人类疾病和细菌性传染病相关的功能在肠道中显著富集；肝胰腺腺中显著富集的功能为卟啉和叶绿素代谢。