近日，国际著名期刊Nature Metabolism(IF:19.865)，发表了一篇题为“The antitumour effects of caloric restriction are mediated by the gut microbiome”的研究论文。该文章由复旦大学王立顺团队发表。研究通过16S rRNA测序技术，鉴定了双歧杆菌的富集。此外还构建了小鼠肿瘤模型，通过CR（热量限制）或者IF（间接性禁食）干预策略，发现CR的抗肿瘤作用（而不是IF），取决于肠道菌群的肿瘤浸润IFN-γ+CD8+ T细胞的积累，这种效果可能归结于乙酸的产生。研究结果表明，CR可以调节肠道分类组成，这在肿瘤生长动力学和癌症免疫监测中具有重要的意义。

图1  文章发表信息

CR包括在没有营养不良的情况下减少每天的热量摄入15-40%。在过去的几十年里，许多研究已经证实：CR可以延长寿命，延缓与年龄相关的疾病的进展。CR可以在许多不同的生物体中发挥抗肿瘤作用，包括人类。各种形式的能量限制，如间歇性禁食（IF），也可以保护新陈代谢和健康，并具有抗肿瘤作用。CR和没有营养不良的间歇性禁食（IF）可降低癌症发展的风险。另外，CR和IF也可导致肠道微生物群重构。然而，肠道微生物群是否在与CR或IF相关的抗肿瘤缺陷中发挥作用尚不清楚，该文章以此展开试验和讨论。

使用无菌和抗生素诱导的微生物组消耗小鼠模型结合粪便微生物群移植（FMT）来探索CR或IF的抗肿瘤作用是否由肠道微生物组介导。

测序策略：二代扩增子测序

测序平台：Illumina NovaSeq 

（1）通过CR或者IF干预肿瘤小鼠模型（同时使用或不使用抗生素），CR干预可通过肠道菌群抑制皮下肿瘤的形成；

（2）CR干预后小鼠肠道中双歧杆菌属显著富集，补充双歧杆菌以CD8+T细胞依赖方式发挥抗肿瘤效果；

（3）双歧杆菌上清液可上调肿瘤浸润CD8+ T细胞，从而促进CR的抗肿瘤作用；

（4）定量分析发现上清液中乙酸含量显著升高，补充乙酸（而不是丙酸）通过IFN-γ+CD8+ T细胞积累调节抗肿瘤作用。

1、肠道微生物群介导了CR抗肿瘤作用

为了评估CR和IF的抗肿瘤作用是否由肠道微生物群介导，建立了一个小鼠模型。在自由喂养的小鼠和使用或不使用广谱抗生素进行CR或IF治疗的小鼠中评估肿瘤生长情况。将小鼠分为自由抗生素组、CR组、IF组、自由抗生素+自由组、自由组+ CR组和+ IF组，在自由喂食的一组（对照组）中，小鼠被喂食正常的食物。CR组给予自由喂食组摄入量的60%。IF组每周禁食48 h，总热量摄入量与CR组保持一致。我们在MC38腺癌细胞皮下注射肠道微生物群；每周给小鼠两次抗生素。第35天采用16S rRNA分析法分析肠道微生物群，以评估耗竭效率。Shannon和Chao1指数分别显示，抗生素显著降低了肠道微生物区系的群落多样性和丰富度，说明了抗生素治疗的有效性。在35d的时间段内，CR和IF均降低了小鼠的平均体重。与CR组相比，没有接受CR（抗生素+ CR）治疗的小鼠体重减轻更少，这与之前的研究一致。然而，用抗生素处理的IF小鼠和用IF处理的小鼠的体重没有显著差异。

为了检测肠道微生物群是否与CR处理的小鼠的抗肿瘤作用有因果关系，我们使用了FMT。我们将CR处理小鼠（CR的FMT）、IF处理小鼠（IF的FMT）或年龄匹配的对照小鼠（FMT）的粪便微生物群移植到抗生素处理的受者中，随后皮下注射MC38腺癌细胞。CR-和if-移植小鼠在食物和热量摄入量方面没有差异。与IF组或AL组的FMT进行比较肿瘤体积，CR组FMT小鼠的最终肿瘤重量显著降低。因此，这些发现提示肠道微生物群可能是CR抗肿瘤作用的一个重要贡献者。此外，使用无菌小鼠来证实CR的抗肿瘤作用，而不是IF，依赖于肠道微生物群。发现，CR不能抑制这些无菌小鼠的肿瘤生长。然而，IF仍然可以抑制肿瘤生长，降低肿瘤重量。总之，这些结果表明，CR，而不是IF，抑制了肿瘤的生长，并且这种效应依赖于肠道微生物群。

图2 肠道微生物群介导了CR的抗肿瘤作用，而不是IF

2、双歧杆菌在CR处理的小鼠中尤其常见

为了检测哪些特定的微生物组成分介导了CR的抗肿瘤作用，收集了CR处理小鼠、if处理小鼠和自由喂食（对照）的小鼠的粪便物质，然后进行16S rRNA测序：主坐标分析（PCoA）显示，CR小鼠和自由喂食的小鼠之间的肠道微生物群没有显著变化。在门水平上，CR和if处理后的小鼠肠道微生物群发生了不同的变化。通过16S rRNA测序发现：CR和IF处理减少了观察物种的数量和ACE指数。而Simpson指数在三组间没有显著性差异。采用线性判别分析（LDA）和热图分析，结果表明：在CR中，双歧杆菌属和乳酸杆菌属明显有过多的代表。LDA效应大小（LEfSe）表明放线菌及其属级双歧杆菌代表过多，结果与门水平分析一致。此外，采用LDA分析和t检验比较了CR和IF的微生物组成，结果显示，双歧杆菌是CR和IF之间分化最显著的属。因此，与自由小鼠和IF小鼠相比，CR处理后双歧杆菌的丰度也过高，表明双歧杆菌的过度代表与饮食节律特异性相关，但与减少热量摄入无关。总之，这些数据表明双歧杆菌在CR处理小鼠的肠道微生物群中占过多的比例。

图3 放线菌及其双歧杆菌属在CR处理小鼠的肠道微生物群中有过多的比例

3、双歧杆菌的抗肿瘤作用

为了检测双歧杆菌是否足以在没有肠道微生物群的情况下挽救CR的抗肿瘤作用，鉴定了5种双歧杆菌，并将其灌胃给抗生素+ CR受者。发现双歧杆菌显著抑制了肿瘤的生长。此外，还证明了补充双歧杆菌在自由喂食的小鼠中，单独使用两歧可以抑制肿瘤生长，表明双歧杆菌能够模拟CR的抗肿瘤作用。此外，在4T1乳腺癌细胞系小鼠模型中检测了CR和双歧杆菌。将4T1癌细胞原位植入BALB/c小鼠的乳腺中。CR和两歧杆菌治疗延迟了4T1原发肿瘤生长和降低了肿瘤重量，而没有肠道微生物群（抗生素+ CR）的小鼠没有表现出任何抗肿瘤活性。肺癌中的癌细胞转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。总之，这些数据表明双歧杆菌在CR介导的抗肿瘤反应中是一个正的调节因子。

为了确定CD8+ T细胞是否为效应细胞双歧杆菌介导的抗肿瘤作用，腹腔注射抗cd8抗体到CR，从CR或双歧杆菌小鼠。抗cd8抗体治疗后，肿瘤生长速度比未治疗的对照组快。抗cd8治疗增加了CR、CR和FMT的肿瘤重量双歧杆菌组。流式细胞术分析显示，抗CD8抗体处理后小鼠脾脏CD8+ T细胞百分比显著降低双歧杆菌，这些结果表明：双歧杆菌以CD8+ T细胞依赖的方式挽救了CR的抗肿瘤作用。

之前的研究和最近的研究表明，来自肠道微生物群的代谢物可以通过调节肿瘤浸润的CD8+ T细胞来提高其抗肿瘤作用。为了检测是否双歧杆菌通过其代谢物发挥抗肿瘤作用，收集了其的上清液并用于补充口服抗生素+CR处理小鼠上清。与抗生素+CR治疗组相比，小鼠被给予双歧杆菌上清液显示明显的肿瘤消退，提示双歧杆菌可能通过其上清液影响CR介导的抗肿瘤作用。进一步使用流式细胞术分析了肿瘤环境中的IFNγ+ CD8+ T细胞，发现其上清液为双歧杆菌增加了肿瘤浸润的IFNγ+ CD8+ T细胞的百分比，表明小鼠用上清液处理双歧杆菌可上调肿瘤浸润的CD8+ T细胞，从而促进CR的抗肿瘤作用。

图4  CR以肠道微生物依赖的方式增加IFNγ+ CD8+ T细胞

4、醋酸盐具有CR的抗肿瘤作用

量化了SCFAs的水平，以确定双歧杆菌上清液中有助于CR治疗的抗肿瘤作用的特定成分。在双歧杆菌上清液中，发现醋酸盐水平显著升高。因此，与自由喂食的小鼠相比，CR处理的小鼠的醋酸水平较高，而乙酸、丁酸和丙酸水平较低。此外，还测量了自由治疗、CR或IF治疗后小鼠肝脏、血浆和肿瘤中SCFAs的浓度。结果表明，补充双歧杆菌后，血浆和肿瘤中醋酸盐水平略有升高，而肝脏中没有升高，说明醋酸盐可能具有抗肿瘤作用。为了证实醋酸盐在cr介导的抗肿瘤作用中的作用，用醋酸盐补充了抗生素+cr处理的小鼠，并补充了丙酸作为对照，补充醋酸盐，而不是丙酸。在抗生素+中，CR小鼠足以挽救CR的抗肿瘤作用。与这些结果一致的是，流式细胞术显示醋酸处理后肿瘤浸润IFNγ+ CD8+ T细胞的百分比增加，表明醋酸通过IFNγ+ CD8+ T细胞的积累调节抗肿瘤作用。综上所述，表明醋酸可能是CR介导的抗肿瘤作用的关键调节因子。

图5 醋酸盐促进了CR的抗肿瘤作用