产品背景
微小残留病 (Minimal Residual Disease, MRD)是指白血病、淋巴瘤和骨髓瘤患者经治疗缓解后，体内仍残留少量癌细胞的状态，最终可能会引起疾病复发。监测血液肿瘤MRD水平对于患者疾病的治疗非常重要，能够为疾病的预后和治疗效果评估提供重要参考。
血液肿瘤患者治疗缓解后残留的血液肿瘤细胞数量一般较少，需要用非常灵敏的方法来进行检测。传统的MRD检测评估方法如下：
1
// 流式细胞法
利用白血病细胞和正常细胞间抗原表达异常区分白血病细胞和正常细胞，是目前应用最广泛、最快速的方法。但是只有那些和正常细胞（包括正常幼稚细胞）间存在明显不重叠差别的抗原或抗原组合才能用于MRD监测；并且常规的流式细胞法检测的敏感性只有10-4；同时白细胞表面抗原的免疫漂移现象会干扰MRD的检测。
2
// 融合基因定量RT-PCR
监测灵敏度高，但只有不到50%病例存在特异性融合基因改变，使该方法的使用受到了限制。
3
// IG/TCR重排定量PCR
监测灵敏度高，线性好，90-95%以上病例可用此方案。但该方法需构建患者的特异性探针，操作繁琐，且比较费时，初诊时的某些微小克隆在设计引物时容易被忽略，同时会由于白血病克隆进化带来的探针结合区域的基因突变而造成漏检。
虽然流式细胞学和定量PCR是目前主流的MRD检测方法，但由于其特异性及灵敏度不够以及适用范围的局限性，很难在每例患者中都找到相应的标志物。但B/T淋巴细胞的血液肿瘤都分别存在BCR和TCR基因的V（D）J的重组，可以作为高特异性和灵敏性的肿瘤标志物进行监测。2022年版国际临床实践指南（NCCN）、2021年版《中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南》推荐基于BCR/TCR免疫组库测序的MRD检测，下面我们针对此方法做详细的介绍。
检测原理
组成B细胞表面受体（BCR）和T细胞表面受体（TCR）的基因在胚系基因组中以V（Variable）, D（Diversity）和J（Joining）片段的形式存在。在淋巴细胞发育分化过程中，细胞中的BCR和TCR的V（D）J基因片段会重新组合形成不同的BCR/TCR克隆重排（如下图）。
正常淋巴细胞的V(D)J重组重排是随机的，细胞表现为多家族和多克隆性，充分发挥各种细胞免疫作用的潜能。而在淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤发生过程中，淋巴细胞在某一个或几个特定的BCR/TCR基因重组重排的细胞中发生恶性转化，导致在淋巴结、骨髓或者外周血中出现主要的淋巴细胞单克隆性表达。临床上应用这一独特特征，将BCR/TCR克隆重排检测用于淋系血液肿瘤的辅助诊断和MRD监测。
基于BCR/TCR免疫组库测序的MRD检测技术克服了以上流式细胞学和定量PCR技术的局限性，针对BCR/TCR基因重排，只需要一套通用引物，即可获得所有的BCR/TCR克隆重排碱基序列，在分析足够数量的细胞时灵敏度可达10-6（在100万个骨髓/外周血有核细胞中检测到低至1个癌细胞），相当于敏感度提高了一百倍。我们先对治疗前肿瘤样本的BCR/TCR进行多重PCR扩增和测序分析，确定与疾病相关的肿瘤克隆，然后对初筛样本中确定的高频克隆序列进行追踪，监测治疗后样品中肿瘤克隆负荷水平，准确的评估MRD水平。同时获取治疗期间和治疗后的与预后相关的B细胞和T细胞的信息，用于免疫系统多样性、免疫重建等分析。
注：不论何种检测方法，均推荐使用骨髓标本，灵敏度高于外周血1~3个对数级。且不论使用何种检测方法，检测灵敏度均需至少≥10-4。
检测流程
检测结果
（1）克隆多样性分析——免疫系统免疫细胞多样性越高，系统越稳定，对抗原的抵抗力也越强；相反，如果免疫系统中仅有少数克隆，那么免疫系统多样性很低；
（2） V/J Usage统计——肿瘤特异的V、J基因及V-J基因对的使用频率变化与MRD关系密切；
X轴为V基因，Y轴为J基因，Z 轴为reads 数目
（3）免疫组库的Top3克隆占比——分布一般呈现平均多样化，而淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的某些B、T细胞过度扩增，其某些克隆会急剧增多，超过平均分布；
（4）Top3克隆占比——监测
适用人群
注：本方法仅适用于淋巴样血液肿瘤，不适用于髓系及其他非淋系的样品
灵敏度
总 结
血液肿瘤的发病率和死亡率有逐年增高的趋势，对血液肿瘤残留病灶的准确监测是精准治疗的基础。可以早期预测白血病复发、对病人的危险程度进行分层、指导缓解后治疗以及确定骨髓或干细胞移植的最佳时间。在NGS技术的驱动下，高灵敏度的BCR/TCR免疫组库测序正逐渐替代传统的检测方法，为MRD检测的提供了更好的应用前景。
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