图1 文章信息

1、进化过程中保守的古TAD，Zfp42R和Fat1共享调控环境但单独表达

Zfp42（Rex1）是一个备受研究的多能性转录因子。该研究构建小鼠E11.5胚胎肢体的cHi-C图谱，Zfp42位于一个CTCF分界的TAD内，与真兽类哺乳动物特异性基因Triml1和Triml2一起位于TAD中央293 kb区域（Zfp42R）。该TAD包含有Zfp42和Fat1等8个基因，TAD中Fat1和Mtnr1a在所有脊椎动物中相对保守，并且位置靠近TAD边界。

研究继续取鸡和负鼠的胚胎肢体构建Hi-C图谱，结合多个不同脊椎动物的Hi-C数据再处理，确认胎盘哺乳动物的TAD在脊椎动物中是保守的，相对于二倍体基因组，保持了基本恒定的长度。并且Fat1及其保守的单基因TAD在祖先脊椎动物中共同进化，Zfp42R是在真兽类胎盘哺乳动物整合入该TAD。

图2 保守的TAD结构

图3 Fat1与结构稳定的TAD和功能保守的增强子共同进化

该研究进一步构建小鼠胚胎发育的CAGE（cap analysis of gene expression）和scRNA-seq图谱，Zfp42R和Fat1在ESC、胎盘滋养层(TSC)，以及胚胎外胚层和内胚层中共同转录，但Zfp42R在原肠胚形成后不活跃。WISH进一步予此进行了证实。因此，Fat1和Zfp42R共享调控环境，但基本上是独立表达的。

2、ESC中，Fat1和Zfp42在TAD中利用各自增强子进行活动

在E11.5肢体中，ChIP-seq H3K27ac标记的潜在增强子信号聚集在TAD的边界附近和Fat1的基因体内。在ESC中，活性增强子信号有两簇聚集在Zfp42R和Fat1基因体区，并且Zfp42R和Fat1与边沿的基因沙漠1和2（D1&D2）没有互作。据此，包括小鼠的8细胞胚胎和人的ESC，在Fat1和Zfp42都活跃的多能真兽动物细胞中，古TAD可划分为四个结构域（D1、Zfp42R、D2和Fat1），且Fat1和Zfp42R仅和各自的局部增强子互作。

研究人员构建了一系列E11.5胚胎和ESC突变体（ΔZfp42R、ΔD1、ΔD2、ΔD1+2）。E11.5 肢芽RNA-seq显示，Fat1的表达因D1和D2缺失而受严重破坏，和增强子Fat1-enh的缺失一致，但不受新出现的Zfp42R影响。相比之下，Zfp42R基因在野生型和所有突变体肢体中仍然没有活性。因此，在发育后期，Fat1的表达是由其古TAD和远端增强子调控的，但这些对Zfp42R的表达没有影响。在ESC中，Fat1和Zfp42R表达在突变体中普遍不受影响，说明Fat1和Zfp42R只利用其在古TAD中各自隔离的区域内部增强子进行活动。这意味着在多能性过程中，Fat1和Zfp42R基因在功能上是相互独立的。

图4 多能性过程中，Fat1和Zfp42在TAD中利用各自增强子活动

3、ESCs中Zfp42/Fat1 TAD分区和区室化（Compartmentalization）有关

CTCF和cohesin亚基Rad21的结合位点在ESC的Zfp42R内特别富集。然而，在ESC删除CTCF（（dCTCF））或Rad21（dRad21）后，Zfp42/Fat1位点继续分割成四个结构域。因此，Zfp42/Fat1TAD分区在ESC中的发生不依赖CTCF和loop挤压。

图5 TAD分区在ESC中的发生独立于CTCF和loop挤压

通过Hi-C和DamID-seq（ Lamin B1）构建E11.5肢体和ESC compartment特征图谱，另外应用3D-SIM通过Lamin B1免疫标记对NE进行可视化，对染色质结构特征综合分析。据此发现，活性和非活性染色质在肢体的完整TAD中成功结合，但在ESC中分割成不同的区间。

在肢体中，无活性的Zfp42R与D1和D2结合成一个附着NE的大B compartment，横跨大部分的TAD。相比之下，Fat1位于一个活跃的A compartment内，与Fat1-enh一起，并保持与NE的局部分离。因此，完整的肢体TAD同时支持多个非活性和活性compartment。在ESC中，活跃的Fat1和Zfp42R与它们的近端增强子重新组织成分开的A compartment，拥有较低的NE接近度，与D1+D2的交融程度较低。D1和D2本身仍然是与NE相连的B compartment，但很难相互融合在一起。ESC中的Zfp42R、D1、D2、Fat1以分离结构存在，并且loop挤压消除可进一步加强这种分区。综合来看，在ESCs中，由染色质状态定义的拮抗性compartment凌驾于环挤压之上，分解TAD。

图6 Zfp42/Fat1 TAD在肢体中适应不同的染色质环境，但在ESC中发生重组

4、肢体中，DNA甲基化使得Zfp42对Fat1调控信息不敏感

发育后期的胚胎肢体中，尽管在共享的完整TAD中接触Fat1及其远端肢体增强子，Zfp42R基因仍然不活跃。LAD（Lamina-associated domains）是紧凑的异染色质结构域，可以抑制转录。通过在TAD内的7个位置和TAD外的1个位置整合最小的β-球蛋白（Glob）启动子-LacZ传感器结构，绘制Fat1调节活动，研究人员发现，LAD既不直接沉默Zfp42R基因，也不间接阻止其与Fat1增强子的联系。

将Zfp42、Triml1/2或Fat1核心启动子交换到LacZ调控传感器中，并将这些定位在Zfp42Rb，重现了Fat1样的肢体、面部和耳朵LacZ活动模式。结合胚胎肢体的qPCR，表明调控存在某种程度的选择性。然而，这些增强子-启动子兼容性的差异不能解释后期胚胎中Zfp42R基因的完全无活性。

对已发表的ChIP-seq进行分析，在E11.5肢体的Zfp42R启动子处没有H3K27me3或H3K9me3信号富集，从而排除了多梳蛋白和经典异染色质化作为沉默机制的可能性。然而，WGBS发现肢体芽和ESC之间围绕Zfp42和Triml1/2启动子的差异甲基化区域。基于分析结果，研究推断，高度环境特异性的DNA甲基化使Zfp42R基因对后期胚胎组织中的Fat1增强子活性永久不敏感。

随后，研究人员生成了缺乏DNA甲基转移酶3B（Dnmt3b）的E11.5胚胎，结合Dnmt3b^−/−胚胎肢体的WGBS、ΔD1+D2胚胎的RNA-seq等分析，发现内源性Zfp42启动子对Fat1肢体增强子不敏感，确认它至少是由DNMT3B驱动的DNA甲基化而沉默的。

图7 DNA甲基化使得Zfp42对Fat1调控信息不敏感

5、基因冲突表达常见于多基因TAD

从上可知，至少有两种机制可以适应单一的调控环境，以在进化中承载多个表达程序。最后，研究人员利用Hi-C和FANTOM5表达数据，量化了这种表达在全基因组调控环境下的普遍性。在几种小鼠细胞的2400个左右TADs中，有约12%仅包含一个在发育GO-terms中富集的基因，88%左右的TAD包含多个基因，研究人员将其分为普遍（Ubiq.）或非普遍（non-Ubiq.）两类。像Zfp42/Fat1结构域这样的多基因TAD在基因组中占主导地位，经常包含多个non-Ubiq.“发育的”和Ubiq.“管家”基因。随后，基于共表达分析，发现“发育的”non-Ubiq.基因位于同一TAD中时，会更频繁地共同表达，“管家”Ubiq.基因则不然。因此，像Zfp42/Fat1一样，在共享的TAD调控中，冲突的发育基因表达是进化过程中基因组的一个普遍特征。并且丢失的DNA甲基化优先激活的启动子是发育性的和接近同一TAD中其他发育性位点的增强子的。

这一起表明，在进化过程中，随着基因的出现或被重新排列到共享结构域中，调节冲突经常出现。然而，这种冲突可以通过DNA甲基化驱动的沉默、三维重组，以及可能的其他合作机制来调节。

图8 基因组中冲突调节是普遍的

图9 机制模型