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重磅项目文章!基因组功能稳健,人造单条染色体酵母又添力作!

发布时间:2022-9-29 14:20:13阅读次数: 分享到:

染色体是遗传信息从亲代向子代传递的载体。在真核生物中,从一条染色体的雄蚁(Myrmecia pilosula)到数千条染色体的蕨类植物(Ophioglossum reticulatum),不同生物具有不同数目的染色体。在某些物种进化的过程中,不同染色体之间会发生融合进而导致染色体数目减少。染色体的数目和结构是否影响以及如何影响生物体的适应性和物种形成仍不清楚。


近日,中科院分子细胞科学卓越创新中心周金秋研究员、北京生命科学研究所杜立林研究员和中国科学技术大学符传孩教授团队联合菲沙基因在著名学术期刊Cell Reports以“Single-chromosome fission yeast models reveal the configuration robustness of a functional genome”为题发表研究成果。为了探究极端染色体构型改变对酿酒酵母(S. cerevisiae)以外的真核生物的影响,该研究使用了含有三条天然染色体的裂殖酵母(S. pombe)作为模式生物,成功构建了几种单染色体S. pombe菌株,其中三个天然染色体以不同的顺序融合成一个巨型染色体。野生型和单染色体菌株多重比较分析发现,伴随着端粒和着丝粒的敲除,染色体融合导致染色体三维结构发生剧烈变化,绝大部分染色体间相互作用消失,但对整体基因表达的影响很小。此外,与野生型菌株相比,单染色体菌株在细胞形态、有丝分裂、基因毒素敏感性和减数分裂方面几乎没有缺陷。然而,当把野生型和单染色体菌株进行杂交,或者把两个具有不同融合顺序的单染色体菌株进行杂交后,都会导致减数分裂异常和孢子存活率降低。这些研究结果表明,真核生物基因组的稳健性使得裂殖酵母能忍受剧烈的染色体变化;染色体融合后的三维结构变化对基因表达的影响较小;染色体数目和结构的改变对生殖隔离和物种形成具有重要影响。


图1 文章信息


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研究思路

研究材料:野生型和染色体融合裂殖酵母

研究方法:

  • 组学:PacBio HiFi 基因组测序、Hi-C、RNA-seq

  • 其他:ChIP-qPCR、脉冲凝胶电泳、Southern blotting、细胞形态和生长分析、基因毒素敏感性测定、孢子形成测定


图2 研究思路


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研究结果

1.单染色体裂殖酵母菌株的构建

首先,该研究获得了两种双染色体菌株(Chr3-2和Chr1-3)。在Chr3-2和Chr1-3菌株中,融合的染色体有两个着丝粒,菌株却没有任何生长缺陷,先前的研究报道以及Cnp1和H3K9me2 ChIP-qPCR的结果表明,这是由于融合染色体上着丝粒cen3发生了表观遗传调控的着丝粒失活,导致着丝粒cen3失去其功能,进而融合染色体上只有一个着丝粒发挥功能。之后,在Chr3ci-2和Chr1-3ci菌株的基础上,研究人员在进行剩余染色体融合的同时敲除了其着丝粒区域,得到了Chr3ci-2-1和Chr2-1-3ci两种单染色体菌株。进一步敲除这两个菌株中失活的着丝粒(inactivated cen3),得到了另外两种单染色体菌株Chr3-2-1和Chr2-1-3。因此,该研究总共获得了四种单染色体菌株。这四种菌株具有两种不同的染色体顺序,而同一染色体顺序的单染色体菌株也存在两种形式,一种是包含两个着丝粒(一个有活性,一个失活),另一种只包含一个着丝粒(有活性)。


图3 四种单染色体裂殖酵母


接下来研究人员对四种单染色体菌株进行验证,包括对染色体融合和着丝粒敲除处先PCR后测序,PFGE核型分析,Chr3ci-2和Chr3ci-2-1菌株着丝粒活性分析(Cnp1和H3K9me2 ChIP-qPCR)和端粒信号分析(Southern blotting)。在Chr3ci-2和Chr3ci-2-1菌株中,着丝粒cen3的核心区域cnt被含有H3K9me2修饰的核小体所占据,发生表观遗传失活,失去着丝粒的功能。在野生型,Chr3ci-2,Chr3ci-2-1和Chr3-2-1菌株中,端粒数目从6个减少到2个,端粒信号也逐渐减弱。此外,基因组HiFi测序联合Hi-C组装的结果显示,亲本野生型菌株能组装出三条染色体,而四种单染色体菌株都只能组装出一条融合后巨大的染色体,这一结果进一步证实了单染色体菌株的成功构建。


图4 单染色体和亲本野生型菌株基因组共线性极好


2.单染色体裂殖酵母菌株的三维结构

在野生型菌株中,三条染色体的着丝粒彼此间存在强烈地相互作用。Chr1和Chr2的端粒和亚端粒也存在强烈地互作,并且是染色体间主要的长距离强相互作用。在单染色体菌株Chr3-2-1和Chr2-1-3中,被删除的着丝粒两侧和染色体融合位点两侧被人为的连在了一起,导致这些位置出现了新的相互作用。因为在单染色体菌株中敲除了两个着丝粒,所以保留的单个着丝粒缺乏与之产生相互作用的区域,表现为相互作用的消失(染色体间的相互作用来自于非同一条染色体上的基因座之间)。除了染色体融合处保留的亚端粒区域之间存在一定的相互作用外,融合处保留的亚端粒区域还与Chr1或Chr2游离端的端粒和亚端粒,以及部分交配型的异染色体区域存在相互作用。有趣地是,在单染色体菌株Chr3ci-2-1和Chr2-1-3ci中,失活的cen3没有与有活性的着丝粒相互作用,而是与Chr1或Chr2游离端的端粒和亚端粒产生相互作用,这与之前ChIP-qPCR证实的cen3发生表观遗传失活,变成异染色质的结果相一致。所以异染色质化的cen3倾向于和异染色质状态的端粒聚集在一起。


图5 WT菌株和单染色体菌株-Chr3-2-1和Chr2-1-3中的染色质相互作用


在野生型菌株的基因组三维结构模型中,三条染色体呈现出典型的Rabl构型,着丝粒聚集在一侧,端粒聚集在另一侧。而在单染色体菌株的基因组三维结构模型中,染色体融合极大地改变了染色体的三维结构,融合染色体表现为球状和相对松散的构型,Chr1或Chr2游离端的端粒在空间上也靠近染色体融合区域。


图6 野生型和单染色体菌株Chr3-2-1和Chr2-1-3的三维构型


3.单染色体裂殖酵母菌株的基因表达

在野生型和单染色体菌株的RNA-seq比较分析中发现,90%以上的基因的表达水平在单染色体菌株中没有明显变化,差异表达的基因(DEGs)分布在整个融合染色体上。在单染色体菌株中,Chr1(Chr3-2-1)或Chr2(Chr2-1-3)上保留的端粒的附近基因表达下调,这意味着端粒位置效应增强。考虑到单染色体菌株的构建过程,在GO富集分析时重点关注了与动粒、核糖体生物合成和端粒组成有关的基因。与动粒相关的DEGs有15个,其中5个基因(glm2,cut7,bub1,sim4cut14)在两种单染色体菌株都下调。对于核糖体生物合成相关基因,绝大多数的DEGs都是表达下调,可能是由于敲除了S. pombe近一半的rDNA串联重复序列。与端粒组成相关的DEGs有10个,其中rif1pof3在两种单染色体菌株中都下调。KEGG富集分析发现,两种单染色体菌株中前10条富集的KEGG途径都是代谢途径,并且大部分上调的途径是代谢途径,下调的途径包括自噬、细胞周期和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导。


图7 DEGs广泛分布在融合染色体上


4.染色体融合在细胞形态和生长方面造成的缺陷很少

单染色体菌株的表型和适应性分析表明,裂殖酵母可以耐受染色体数目和构型的极端改变。首先,单染色体细胞不仅在大小和形状上与野生型细胞没有区别,其生长速率与野生型细胞也差别不大。另外,单染色体和野生型菌株在有丝分裂纺锤体的长度和动力学进程也同样相似。野生型和染色体融合菌株在丰富型培养基固体板上的菌落生长也没有明显差异,表明单染色体菌株可以保持其自我更新能力。其次,当用基因毒素处理细胞时,单染色体菌株对羟基脲(HU,一种核糖核苷酸还原酶抑制剂)和甲基磺酸甲酯(MMS,一种DNA损伤剂)略为敏感,对喜树碱(CPT,一种拓扑异构酶I抑制剂)的反应与野生型菌株类似。有趣地是,单染色体菌株以及双染色体菌株(Chr3ci-2和Chr1-3ci)对微管解聚剂噻菌灵和多菌灵的敏感性则低于野生型菌株,推测可能是染色体融合菌株的着丝粒数量较少,减少了细胞分裂过程中对微管的需求。


图8 染色体融合在细胞形态和生长方面造成的缺陷很少


5.染色体数目和基因组结构影响减数分裂和物种形成

为了探究重塑染色体结构对有性繁殖的影响,在异宗配合单染色体菌株h+的基础上,研究者通过交配型转换获得了另一种交配型的异宗配合菌株(h)和同宗配合菌株(h90)。野生型和单染色体同宗配合菌株(h90)能够得到正常的子囊,并且生成的四个孢子都能存活。Chr3ci-2-1h)和Chr3-2-1h+)或Chr2-1-3cih)和Chr2-1-3h+)之间的杂交也呈现正常的孢子存活率。而当把单染色体菌株与野生型菌株进行杂交时,大多数的孢子数少于四个,并且即使是来自四孢子子囊的孢子存活率也较低。此外,当把具有不同融合顺序的单染色体菌株进行杂交时,孢子存活率也严重下降。这些结果表明,染色体数目或结构的差异对减数分裂是非常有害的,并且可能导致杂交不相容,类似于真核生物物种之间的生殖隔离。


图9 染色体数目或构型的不同对减数分裂不利


小  结

该研究将S. pombe的三条天然染色体按不同的顺序融合成一条,获得了几种不同的单染色体菌株。并基于PacBio HiFi测序,结合Hi-C、RNA-seq和ChIP-qPCR等方法,对单染色体菌株的进一步鉴定,结果表明S.pombe的功能基因组可以耐受染色体数目和基因组结构的巨大变化。


本研究中,中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所顾欣博士为第一作者,中科院分子细胞科学卓越创新中心的周金秋研究员,北京生命科学研究所杜立林研究员为共同通讯作者,中国科学技术大学符传孩教授提供了非常重要的帮助。菲沙基因基因组事业部王欢、表观遗传事业部卢锐,菲沙医学检测事业部李伟为合作作者参与了该研究。该研究得到了国家重点研发计划(2019YFA0109902)、上海市科委(18JC1420202)和国家自然科学基金委创新研究群体基金(31521061)的支持。

参考文献:

Gu X, Ye T, Zhang X R, et al. Single-chromosome fission yeast models reveal the configuration robustness of a functional genome[J]. Cell Reports, 2022, 40(8): 111237.

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