近日，北京大学基础医学院张卫光教授团队在生化与分子生物学领域权威期刊Redox Biology（IF：10.787）在线发表了题为“CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease”的研究论文。该研究通过比较帕金森病小鼠模型和野生型小鼠之间差异表达的circRNAs（DECs），发现circSV2b在PD小鼠中下调，然后通过一系列实验证实circSV2b直接竞争性结合miR-5107-5p，缓解其对靶基因Foxk1表达的抑制，进而正向调节Akt1转录。circSV2b的过表达通过ceRNA-Akt1轴在PD模型中抵抗氧化应激损伤，miR-5107-5p-Foxk1-Akt1轴可能作为circSV2b过表达在PD治疗中的关键靶点，并强调circSV2b在血清外泌体中的显著变化。因此，circSV2b可能是诊断和治疗PD的一个新型生物标志物。

菲沙基因承担了该研究中转录因子Foxk1的CUT&Tag建库测序及部分分析工作。

图1 文章信息

01.circSV2b可作为PD的诊断和治疗靶标

首先，连续5天对小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）溶液，建立PD小鼠模型。模型构建完成后，进行行为测试，并收集样本。结果显示，MPTP成功减弱了多巴胺的合成，破坏了黑质体功能，并诱发了PD的运动症状。通过对PD小鼠模型的SNpc和STR组织以及对照组织进行RNA-seq，找到STR组织中存在8个上调和25个下调的circRNAs。联合qRT-PCR和FISH实验结果证实，MPTP处理后，circSV2b在SNpc和STR中的表达下调。

CircSV2b来源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由转录后的5-9号外显子通过头尾剪接形成。这既可能是因为反向剪接，也可能是基因组重排的结果。针对这一点，研究者设计实验排除了后者的可能性。而为了评估circSV2b过表达对PD的保护作用，研究者将小鼠分为4组，通过腺相关病毒（AAV）注射过表达circSV2b、行为学实验和MPTP注射，发现circSV2b的过表达可以恢复多巴胺的合成，维持黑质纹状体的功能，并改善MPTP引起的PD小鼠的运动功能。

图2 爬杆实验和步态分析均表明circSV2b过表达可缓解受损的运动平衡

02.CircSV2b通过ceRNA机制发挥作用

位于细胞质的circRNA发挥作用的主要途径是作为miRNA的分子海绵（molecular sponges），circRNA可以与相应microRNA结合，像“海绵”吸附miRNA，使miRNA无法与靶基因结合，进而共同参与调控靶基因的表达。

研究者对N2A细胞进行FISH染色，以及对SNpc组织进行核与质的分离并进行qRT-PCR，确认了circSV2b主要位于SNpc的细胞质中，MPTP处理导致细胞质中的circSV2b明显减少。为了充当分子海绵，circRNA必须与miRNA和AGO2蛋白形成RNA诱导的沉默复合物。通过比较MPTP为了筛选候选的miRNAs，的水平，作者发现MPTP处理后SNpc组织中miR-5107-5p的增加尤为明显。荧光标记实验发现大多数circSV2b、miR-5107-5p和AGO2在细胞质中共定位，进一步的RIP和RNA pull-down实验证实，circSV2b能够与miR-5107-5p相互作用，具有作为miRNA分子海绵的功能。

以往研究证实Foxk1通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制被lncRNA调控。该研究明确了Foxk1在SNpc中表达，并与酪氨酸羟化酶（TH）有协同作用。在N2A细胞中的miR-5107-5p和Foxk1也在细胞质中共定位。miRNA与mRNA的结合也取决于AGO2，使用Foxk1探针进行的RNA pull down实验证实Foxk1确实与AGO2结合。这些结果表明，circSV2b与miR-5107-5p相互作用，miR-5107-5p与mRNA Foxk1相互作用。

图3 circSV2b具有作为miRNA分子海绵的功能

03.Foxk1是Akt1的一个转录因子

由于氧化应激在PD发病机制中的重要作用，研究者使用CUT&Tag技术来筛选Foxk1下游的氧化应激相关靶基因，两个重复样本共得到8013个重叠的peak，对peak相关的基因进行GO注释和富集分析，发现两个样本都在“氧化应激反应”中富集，并且2个样品中Akt1基因的TTS处均存在peak，其motif序列也与Foxk1的binding motif相一致，表明Foxk1是Akt1的一个转录因子。

图4 CUT&Tag技术发现Foxk1的靶基因

04.circSV2b的过表达通过ceRNA-Akt1途径抵抗PD的氧化应激损伤

circSV2b过表达使得miR-5107-5p和Foxk1表达分别下调和上调；相反，circSV2b的干扰表达使得miR-5107-5p和Foxk1分别上调和下调；WB分析显示Foxk1和Akt1的蛋白水平也发生相应变化。通过一系列其它表达变化相关实验，证实CircSV2b调节miR-5107-5p的表达，miR-5107-5p影响Foxk1的表达，而Foxk1则影响Akt1的表达。

此外，为探索circSV2b过表达导致抵抗PD的机制，研究者评估了ceRNA-Akt1途径中各种分子和氧化应激分子的表达变化。结果表明，circSV2b的过表达逆转了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并缓解了Foxk1和Akt 的mRNA及蛋白表达的减少，并减少了MPTP引起的氧化产物MDA的增加，也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性。

图5 circSV2b 的过表达通过ceRNA-Akt1减轻MPTP诱导的氧化应激损伤

图6 circSV2b在MPTP诱导的PD中的作用机制示意图