免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T细胞和B细胞分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答，分别通过其表面的T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）来识别和结合抗原，进而发挥功能清除病原体或体内肿瘤细胞。

免疫组库测序（ImmuneRepertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5’RACE技术进行目的扩增，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

BCR/TCR存在一块区域称作互补决定区（Complementary Determining Region，CDR），在抗原识别中起关键作用；CDR由CDR1，CDR2，CDR3组成，CDR1和CDR2都是由V基因编码，而CDR3则由V、D、J三个基因编码形成，CDR3多样性程度最高。因此，常通过对CDR3区基因序列的研究，对疾病诊断、监测MRD、免疫评估等具有重要意义。

图1 BCR和TCR结构图

（1）5’RACE建库法

对于RNA样本，5’ RACE法正在成为大批量分析TCR&BCR的金标准。这种方法的核心技术少不了CloneTech的SMART扩增，依靠的就是逆转录酶活性。在第一链合成反应期间在cDNA的3’端附加额外的dCTP。总之这种方法能够合成含有mRNA完整5’ 的cDNA，保留完整的VDJ区域及部分C区域。接下来RACE扩增产物用于NGS测序和分析。此技术优于扩增产物一致，也规避的扩增的偏好性。但由于起始材料是RNA，对操作要求相对较高。

图2 5’RACE建库流程图

（2）多重PCR建库法

鉴于目标区域的多样性，多重PCR这种方法目前使用较多。等位基因的扩增引物与已知的V等位基因的扩增引物混合在一起使用。扩增区域可以覆盖整个CDR3区域。多重PCR既适用于DNA样本，也可以针对RNA样本。但是由于引物设计参考了特定的V等位基因，不能检测新的V等位基因突变。此外多重PCR还存在引物扩增偏好性问题，这就会导致后期部分等位基因所得的扩增产物在相对丰度上存在误差。目前主流的方法包括调整引物浓度或使用分子标签（molecular tag或UMI）等技术，可以在一定程度上纠正这种错误。

图3 多重PCR建库流程图

Tip：针对不同需求，选择不同测序平台和测序模式

（1）肿瘤免疫机制：肿瘤免疫过程中的免疫系统的功能和机制研究；

（2）自身免疫疾病：寻找优于现有标准的生物标记物、研究免疫系统在自身免疫中的机制；

（3）抗体开发：抗体库测序，群体免疫反应评估；

（4）感染性疾病：感染过程中免疫动态变化，病原感染biomarker，药物作用机制；

（5）微小残留病：通过检测疾病特征性免疫组库序列图谱，尽早获得疾病治愈及复发信息；

（6）免疫排斥、耐受及重建：移植成功后免疫组库重建，根据多样性和丰度判断排斥反应以及移植是否成功；

（7）用药及疫苗评估：评估是否激发免疫及其药效。