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项目文章丨鲤鱼跃龙门——养殖行业抗生素新生替代品!

发布时间:2022-8-2 10:46:18阅读次数: 分享到:

近日,河南师范大学水产学院常绪路副教授在Aquaculture reports上发表文章“Evaluation of probiotic characteristics and whole genome analysis of Bacillus velezensis R-71003 isolated from the intestine of common carp (Cyprinus carpio L.) for its use as a probiotic in aquaculture ”。该研究利用形态学、16S rRNA测序+全基因组测序分析,鉴定出一株可以同时产生蛋白酶、甘露聚糖酶、淀粉酶和纤维素的分离菌株,名为Bacillus velezensis R-71003,该菌株对大多数病原体显示出拮抗活性,该研究将为芽孢杆菌在水产养殖中作为抗生素替代品的应用奠定了基础。武汉菲沙基因在本研究中承担全基因组测序和分析工作。


图1 文章发表信息


研究背景

过去的几十年中,水产养殖业已成为世界上增长最快的部门,占全球目前食用鱼的近 50%。但细菌、病毒和真菌感染导致的疾病爆发阻碍了全球水产养殖的发展,每年都给养鱼业造成巨大的经济损失。面对这些病害问题,世界范围内水产养殖行业开始滥用抗生素,不仅导致病原菌耐药性增加,而且对养殖场环境造成污染。所以这就带来了一个新的问题,限制使用抗生素,用什么新的策略来控制鱼类疾病的同时又对环境友好。目前,益生菌被认为是一种很有前途的抗生素替代品,可用于水产养殖以控制疾病。


研究思路

材料:河南师范大学一养殖池塘中健康鲤鱼(约70.0 g)的肠道内容物。

测序策略:二代16S测序+全基因组测序


研究结果

1、B. velezensis R-71003 的分离及鉴定

研究人员从健康的鲤鱼肠道中共分离出21株细菌,它们均可产生蛋白酶,其中19株细菌可产生淀粉酶,12株细菌可产生纤维素酶,13株细菌可产生甘露聚糖酶。此外,12种菌株可以同时产生四种酶;进一步研究发现:菌株R-71003其酶生产特性较为突出。基于16S rRNA测序,结果发现:菌株 R-71003与芽孢杆菌属有关。利用PacBio平台对菌株R-71003进行全基因组测序,结果显示该菌株的基因组大小为422,1564 bp,GC含量为46.12%,细胞内存在一个质粒(7410 bp)。菌株R-71003和B. velezensis CR-502T,B. siamensis KCTC 13613T和B. subtilis NCIB 3610T 之间的ANI值分别为98.24%、94.31%和77.18%,小于95%的成对ANI值被认为是不同物种的临界值,这表明菌株R-71003代表了属于B. velezensis的新型菌株。


图2 菌株R-71003的基因组和质粒环状图谱


2、B. velezensis R-71003抗菌特性、生物安全特性及非生物胁迫耐受性

科研人员通过拮抗致病菌试验发现:B. velezensis R-71003对Aeromonas hydrophila、A. veroniiStaphylococcus aureusEscherichia coliEdwardsiella tarda均有抑制作用。特别是A. hydrophilaA. veronii的抑菌圈直径分别为25.25±1.33 mm和23.67 ±1.97 mm,大于其他三种(P <0.05)。抗生素敏感性试验发现:B. velezensis R-71003对氯霉素、庆大霉素、丁胺卡那、头孢唑啉、氨苄西林、青霉素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星和红霉素敏感。溶血实验中B. velezensis R-71003表现出γ溶血。生物安全试验中,B. velezensis R-71003以1×108 CFU/ml浓度对鲤鱼进行腹腔注射,两周内鲤鱼未表现出不健康状况且没有死亡。综合抗生素敏感性试验、溶血实验和生物安全试验,结果表明B. velezensis R-71003对鱼类是安全的。 


科研人员分别研究了B. velezensis R-71003暴露在pH 分别为2、3、4、5的环境下1、2、3和4小时后的存活率、0.3% 胆盐环境下1、2、3和4小时后的存活率和不同温度条件(60、70、80 ℃)下2、5和10 min后的存活率。不同条件下菌株B. velezensis R-71003的存活率结果表明:B. velezensis R-71003表现出优异的非生物胁迫耐受性。


图3 B. velezensis R-71003对A. hydrophila A. veroniiS. aureusE. coliE. tarda的抑菌圈及抑菌圈的直径


图4、B. velezensis R-71003的溶血活性


图5、B. velezensis R-71003的耐胆汁性、耐高温性和耐热性


3、B. velezensis R-71003的基因组分析

B. velezensis R-71003的基因组使用PacBio Sequel II平台进行测序,从头组装产生了完整的染色体基因组和环状质粒。B. velezensis R-71003的完整基因组由4221564个核苷酸组成,GC含量为46.12%。对基因组数据分析,全面了解B. velezensis R-71003在水产养殖中的相关益生菌性状。粘附在宿主肠道上的能力是益生菌菌株最重要的特征之一。B. velezensis R-71003的基因组分析鉴定出编码烯醇化酶和胞外多糖的基因。基因组分析确定了参与氨基酸(如苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸和精氨酸)和维生素(如硫胺素(维生素B1),核黄素(维生素B2),吡哆醇(维生素B6),生物素(维生素B7)和叶酸(维生素B9))生产的几个基因。产生氨基酸和维生素的能力是益生菌的理想特性之一,此外,产生细胞外酶的能力也是益生菌的特性之一。在B. velezensis R-71003的基因组中发现了参与产生α-淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的基因。全基因组分析显示:B. velezensis R-71003含有一些与合成拮抗活性物质有关的基因簇,包括表面活性素、丁酰苷菌素、大环内酯、泛革素、凤霉素、艰难蚴碱、杆菌肽和杆菌苷。B. velezensis R-71003基因组还携带了参与耐温性、耐酸性、胆汁盐耐受性和氧化应激耐受性的各种基因。

表1 B. velezensis R-71003次生代谢产物的预测结果



4、B. velezensis R-71003对鲤鱼抵抗嗜水气单胞菌感染作用

研究者将B. velezensis R-71003以1×108 CFU/g 浓度喷涂到商业饲料上,对鲤鱼进行定时定点定量饲喂60天,同时以未不喷涂B. velezensis R-71003的商业饲料饲喂进行对照。60天后用A. hydrophila以1×108 CFU/ml浓度腹腔注射200μl到鲤鱼体内,5天内观察死亡率。攻毒试验结果表明B. velezensis R-71003能显著提高鲤鱼在感染A. hydrophila时的存活率。


图6、饲喂 B. velezensis R-71003 对鲤鱼感染 A. hydrophila 5 天后存活率的影响


5、葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003的促生长作用

研究者进行不同浓度的葡萄糖酸钠(0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%和2.4%)对B. velezensis R-71003的生长促进作用试验时发现:低浓度(0.3,0.6,0.9%)的葡萄糖酸钠可显著促进B. velezensis R-71003的生长(P <0.05),而高浓度(1.8%,2.1%和2.4%)的葡萄糖酸钠可以显著抑制B. velezensis R-71003的生长。随后又测定生长发育相关基因表达水平,探索低浓度葡萄糖酸钠促进B. velezensis R-71003生长的潜在机制,证实:与无葡萄糖酸钠组相比,0.6%和0.9%葡萄糖酸钠添加组中dnaA(5.37倍)和yabD(6.04倍)基因表达显著上调(P<0.05),而0.3%葡萄糖酸钠对dnaAyabD的表达没有显著影响。



图7 葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003生长及表达相关基因生长的影响


总    结

本研究从鲤鱼肠道中分离出一株产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶甘露聚糖酶的菌株R-71003。此研究基于形态学、系统发育学和全基因组分析表明:

(1)B. velezensis R-71003具有多种益生菌特性:如抗菌活性、良好的低pH值、高胆盐浓度、热处理后的高生存率,以及高的自聚集能力和疏水性;

(2)B.velezensis R-71003没有抗生素耐药性和毒力因子,且具有非溶血性质,从而证实了其作为益生菌应用的安全性。

(3)体外抗菌试验表明:B. velezensis R-71003对A. hydrophilaA. veroniiS. aureusE. coliE. tarda的生长有抑制作用;

(4)攻毒试验表明:B. velezensis R-71003显著提高了普通鲤鱼在受到A. hydrophila感染后的存活率;

(5)葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003的生长促进作用:该物质可作为水产养殖的益生元。

试验后续还需要对B. velezensis R-71003在水产养殖环境中的益生菌效应进行体内评估,确定B. velezensis R-71003在自然条件中的应用。


本研究得到国家自然科学基金(31902361和82001407)和河南师范大学青年基金(2021QK01)的支持。



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