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过去的几十年中，水产养殖业已成为世界上增长最快的部门，占全球目前食用鱼的近 50%。但细菌、病毒和真菌感染导致的疾病爆发阻碍了全球水产养殖的发展，每年都给养鱼业造成巨大的经济损失。面对这些病害问题，世界范围内水产养殖行业开始滥用抗生素，不仅导致病原菌耐药性增加，而且对养殖场环境造成污染。所以这就带来了一个新的问题，限制使用抗生素，用什么新的策略来控制鱼类疾病的同时又对环境友好。目前，益生菌被认为是一种很有前途的抗生素替代品，可用于水产养殖以控制疾病。

材料：河南师范大学一养殖池塘中健康鲤鱼（约70.0 g）的肠道内容物。

测序策略：二代16S测序+全基因组测序

1、B. velezensis R-71003 的分离及鉴定

研究人员从健康的鲤鱼肠道中共分离出21株细菌，它们均可产生蛋白酶，其中19株细菌可产生淀粉酶，12株细菌可产生纤维素酶，13株细菌可产生甘露聚糖酶。此外，12种菌株可以同时产生四种酶；进一步研究发现：菌株R-71003其酶生产特性较为突出。基于16S rRNA测序，结果发现：菌株 R-71003与芽孢杆菌属有关。利用PacBio平台对菌株R-71003进行全基因组测序，结果显示该菌株的基因组大小为422,1564 bp，GC含量为46.12%，细胞内存在一个质粒（7410 bp）。菌株R-71003和B. velezensis CR-502T，B. siamensis KCTC 13613T和B. subtilis NCIB 3610T 之间的ANI值分别为98.24%、94.31%和77.18%，小于95%的成对ANI值被认为是不同物种的临界值，这表明菌株R-71003代表了属于B. velezensis的新型菌株。

图2 菌株R-71003的基因组和质粒环状图谱

2、B. velezensis R-71003抗菌特性、生物安全特性及非生物胁迫耐受性

科研人员通过拮抗致病菌试验发现：B. velezensis R-71003对Aeromonas hydrophila、A. veronii、Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Edwardsiella tarda均有抑制作用。特别是A. hydrophila和A. veronii的抑菌圈直径分别为25.25±1.33 mm和23.67 ±1.97 mm，大于其他三种（P <0.05）。抗生素敏感性试验发现：B. velezensis R-71003对氯霉素、庆大霉素、丁胺卡那、头孢唑啉、氨苄西林、青霉素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星和红霉素敏感。溶血实验中B. velezensis R-71003表现出γ溶血。生物安全试验中，B. velezensis R-71003以1×108 CFU/ml浓度对鲤鱼进行腹腔注射，两周内鲤鱼未表现出不健康状况且没有死亡。综合抗生素敏感性试验、溶血实验和生物安全试验，结果表明B. velezensis R-71003对鱼类是安全的。 

科研人员分别研究了B. velezensis R-71003暴露在pH 分别为2、3、4、5的环境下1、2、3和4小时后的存活率、0.3% 胆盐环境下1、2、3和4小时后的存活率和不同温度条件（60、70、80 ℃）下2、5和10 min后的存活率。不同条件下菌株B. velezensis R-71003的存活率结果表明：B. velezensis R-71003表现出优异的非生物胁迫耐受性。

图5、B. velezensis R-71003的耐胆汁性、耐高温性和耐热性

3、B. velezensis R-71003的基因组分析

B. velezensis R-71003的基因组使用PacBio Sequel II平台进行测序，从头组装产生了完整的染色体基因组和环状质粒。B. velezensis R-71003的完整基因组由4221564个核苷酸组成，GC含量为46.12%。对基因组数据分析，全面了解B. velezensis R-71003在水产养殖中的相关益生菌性状。粘附在宿主肠道上的能力是益生菌菌株最重要的特征之一。B. velezensis R-71003的基因组分析鉴定出编码烯醇化酶和胞外多糖的基因。基因组分析确定了参与氨基酸（如苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸和精氨酸）和维生素（如硫胺素（维生素B1），核黄素（维生素B2），吡哆醇（维生素B6），生物素（维生素B7）和叶酸（维生素B9））生产的几个基因。产生氨基酸和维生素的能力是益生菌的理想特性之一，此外，产生细胞外酶的能力也是益生菌的特性之一。在B. velezensis R-71003的基因组中发现了参与产生α-淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的基因。全基因组分析显示：B. velezensis R-71003含有一些与合成拮抗活性物质有关的基因簇，包括表面活性素、丁酰苷菌素、大环内酯、泛革素、凤霉素、艰难蚴碱、杆菌肽和杆菌苷。B. velezensis R-71003基因组还携带了参与耐温性、耐酸性、胆汁盐耐受性和氧化应激耐受性的各种基因。

表1 B. velezensis R-71003次生代谢产物的预测结果

4、B. velezensis R-71003对鲤鱼抵抗嗜水气单胞菌感染作用

研究者将B. velezensis R-71003以1×10⁸ CFU/g 浓度喷涂到商业饲料上，对鲤鱼进行定时定点定量饲喂60天，同时以未不喷涂B. velezensis R-71003的商业饲料饲喂进行对照。60天后用A. hydrophila以1×10⁸ CFU/ml浓度腹腔注射200μl到鲤鱼体内，5天内观察死亡率。攻毒试验结果表明B. velezensis R-71003能显著提高鲤鱼在感染A. hydrophila时的存活率。

图6、饲喂 B. velezensis R-71003 对鲤鱼感染 A. hydrophila 5 天后存活率的影响

5、葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003的促生长作用

研究者进行不同浓度的葡萄糖酸钠（0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%和2.4%）对B. velezensis R-71003的生长促进作用试验时发现：低浓度（0.3，0.6，0.9%）的葡萄糖酸钠可显著促进B. velezensis R-71003的生长（P <0.05），而高浓度（1.8%，2.1%和2.4%）的葡萄糖酸钠可以显著抑制B. velezensis R-71003的生长。随后又测定生长发育相关基因表达水平，探索低浓度葡萄糖酸钠促进B. velezensis R-71003生长的潜在机制，证实：与无葡萄糖酸钠组相比，0.6%和0.9%葡萄糖酸钠添加组中dnaA（5.37倍）和yabD（6.04倍）基因表达显著上调（P<0.05），而0.3%葡萄糖酸钠对dnaA和yabD的表达没有显著影响。

图7 葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003生长及表达相关基因生长的影响

本研究从鲤鱼肠道中分离出一株产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶甘露聚糖酶的菌株R-71003。此研究基于形态学、系统发育学和全基因组分析表明：

（1）B. velezensis R-71003具有多种益生菌特性：如抗菌活性、良好的低pH值、高胆盐浓度、热处理后的高生存率，以及高的自聚集能力和疏水性；

（2）B.velezensis R-71003没有抗生素耐药性和毒力因子，且具有非溶血性质，从而证实了其作为益生菌应用的安全性。

（3）体外抗菌试验表明：B. velezensis R-71003对A. hydrophila、A. veronii、S. aureus、E. coli、E. tarda的生长有抑制作用；

（4）攻毒试验表明：B. velezensis R-71003显著提高了普通鲤鱼在受到A. hydrophila感染后的存活率；

（5）葡萄糖酸钠对B. velezensis R-71003的生长促进作用：该物质可作为水产养殖的益生元。

试验后续还需要对B. velezensis R-71003在水产养殖环境中的益生菌效应进行体内评估，确定B. velezensis R-71003在自然条件中的应用。