研究者根据瘤胃宏基因组数据预测的CDS克隆了RuXyn基因，测序结果表明：克隆的基因序列与预测的碱基组成完全一致，RuXyn全长为1134 bp，编码377个氨基酸，预测理论分子量为42 kDa。构建了RuXyn的系统发育树，结果表明：RuXyn与Bacteroides ovatus（P49942）、Thermotoga neapolitana（Q60041）、Acetivibrio thermocellus（P10478）和Prevotella ruminicola（P48789）的原核木聚糖酶具有较高的遗传关系。其中，瘤胃前杆菌起源于瘤胃。通过同源建模构建RuXyn的3D结构，并使用木三糖作为配体进行分子对接，结果表明：预测的RuXyn结构中的β-片段被α-螺旋完全包围，形成一个桶状结构，类似于GH10家族蛋白质典型的“沙拉碗”（β/α）₈桶折叠。构建了pET28a-RuXyn载体，并将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，可用于表达和生产RuXyn。SDS-PAGE检测到一条约39 kDa的强蛋白带，经进一步的Western blot分析证实为RuXyn蛋白。

图2  RuXyn基因预测3D结构和分子对接模型

图3  RuXyn的SDS-PAGE和Western blot分析

研究者对RuXyn的pH依赖性和温度依赖性进行了研究，pH依赖性表明：RuXyn活性在pH6.0时最高，pH3.0-5.0和8.0-9.0时急剧下降，表明RuXyn不适用于酸性和碱性环境。尽管家禽的前胃和胃是酸性的，但它们的消化保留时间比小肠要短得多，这可能使它们对RuXyn的影响有限。温度依赖性表明：在40°C时观察到RuXyn的最大活性，当温度升高到60°C时，RuXyn仍能保持最大活性的70%以上。在确定最佳温度和pH值后，本研究考察了RuXyn的热稳定性。结果表明：在20℃预处理后，RuXyn能保持90%以上的活性20°C-40°C持续0.5小时，除了处理温度≥50°C时。此外，还发现Ca²⁺对RuXyn活性有巨大的促进作用，这意味着RuXyn在蛋鸡生产方面显示出巨大的潜力。

图4  RuXyn的最佳pH值、最佳温度和温度稳定性分析

本研究分析了RuXyn对小麦木聚糖的降解产物。木糖三糖是主要产品，其次是木糖五糖、木糖三糖、木糖二糖和木糖。在产生的五种糖中，木糖三糖占46.0%、木糖五糖占28.1%、木糖三糖占12.4%和木糖占10%，表明低聚木糖（XOS）占总糖的96.5%。这意味着RuXyn有更好的能力从小麦木聚糖生产XOS。

图5  RuXyn水解麦秸木聚糖的产物分析

为了研究RuXyn对小麦可溶性木聚糖和不溶性木聚糖的影响，本研究首先将小麦浸泡在缓冲液中2.5h，然后研究了不同剂量的RuXyn对上清液和沉淀中木聚糖的降解作用。随着酶用量的增加，无论上清液或沉淀物状态如何，反应体系中产生的还原糖在0.73U用量下先增加后减少，最后达到最大值。然后分析了反应时间对RuXyn降解小麦的影响，对于上清液中的木聚糖，将反应时间从1小时增加到5小时不会显著增加还原糖的产量。RuXyn可以水解小麦木聚糖，无论是可溶还是不溶，降解产物中的XOS产量占80%以上。