物种：拟杆菌

样品选择：B. taiotaomicron野生菌株VPI-5482（AWS-001）、gibS缺失突变株ΔgibS（AWS-028），tdk缺失突变体Δtdk（AWS-003），gibS互补菌株gibS⁺（AWS-035）

测序策略：smallRNA测序

研究结果：

    1、在AWS-001核基因组和质粒中，共鉴定了4507个TSSs，根据它们的CDS在基因组的位置，将其分为5类(图1)：基本TSS (pTSSs，所有TSSs的40%)、二级TSSs(sTSSs；8%)、内部TSSs（iTSSs；21%)）和反义TSSs(aTSSs；24%)、剩余5%的预测TSSs与任何CDS无关，被分类为孤立TSSs (oTSSs)，这些oTSSs可能反映开放阅读框的不完整注释，或表明存在基因间sRNA基因。TYG培养基中生长的3个不同阶段下的AWS-001，共同鉴定到1951个TSSs，每个生长阶段检测到的TSSs数在2265 ~ 3606之间。大多数TSSs在平稳期检测到，平稳期特异性pTSSs基因在DNA重组、DNA整合和完整的膜成分等GO term中富集。预测的AWS-001 aTSSs显示~22%的aTSSs作为下游CDSs的pTSS，而大多数(73%)被识别的aTSSs产生了相对短的、弱表达的转录本，这表明一些aTSSs可能来自于假性转录起始，并不与功能转录本相关。对所有鉴定的TSSs进行序列比对，显示腺嘌呤和鸟嘌呤是首选的起始核苷酸(分别占45%和41%)。由于嘌呤三磷酸是细胞中主要的能量储存分子，启动子核苷酸中嘌呤碱基的过度表达可能有助于将转录活性与代谢状态结合。

B.thetaiotaomicron转录组图谱中的TSSs

    2、结合TranstermHP和RNAfold, ANNOgesic算法预测了内在转录终止子，与TSSs一起，可以推断转录本边界。B. taiotaomicron表达的转录本长度范围为20nt ~ 18kb(图2)。最长的转录本对应核糖体操纵子、细胞表面和铁转运操纵子、代谢基因簇等。5’UTRs平均和中位数长度分别为52 nt和32 nt。dRNA-seq筛选鉴定出3.7%的拟杆菌5’UTR小于10 nt，13.5%的mRNA具有异常长的(100 nt) 5’UTRs，这些UTRs可能作为sRNAs或RNA结合蛋白(RBPs)的靶向平台，或含有顺式调控RNA元件。其他长5’UTRs含有短的开放阅读框(sORFs)，预示先导肽介导的转录衰减。ANNOgesic预测到TYG培养基生长的B. thetaiotaomicron的409个候选sORF。

B. thetaiotaomicron转录本和5’UTR长度分布

    3、同源TSS上游（–50--+1）启动子搜索发现两个保守基序：Motif 1和Motif 2(图3)。B. thetaiotaomicron中，81%的pTSSs以及60%的sTSSs和oTSSs的上游都发现了Motif 1。Motif 2由TSS 上游-10和-30位为中心的序列元素组成，通常与表达较低的基因相关。某些情况下，启动子基序2 (PM2)驱动的基因转录在稳定生长阶段启动，而不是在早期生长阶段。本研究所有75个PM2编码的基因在氧化应激反应途径显著富集，这些氧化应激相关基因的表达在平稳生长阶段显著上调。

B. thetaiotaomicron TSSs上游的motif

4、dRNA-seq分析发现B. taiotaomicron中大量的非编码RNA分布在整个基因组中(图4)。包括大量的管家转录本，如RNase P (M1 RNA)和tmRNA的RNA组分。B. thetaiotaomicron中检测到了两类pRNA(pRNA和pRNA*)。富培养基（TYG培养基）中生长的B. taiotaomicron分别表达了78个顺反义和124个基因间sRNAs，49个高可信的基因间sRNAs，其中22个sRNAs在拟杆菌门中两个或两个以上属内保守存在，其余27个具有菌株特异性。顺反义sRNAs和基因间sRNAs的核酸碱基组成分析显示GC含量分别为38%和35%，低于CDSs、tRNAs和rRNAs。

B. thetaiotaomicron的非编码RNA图谱

    5、为了在人类肠道的成功定植，B. thetaiotaomicron很大程度上要依赖自身快速适应肠道环境不断变化的能力。本研究为探讨B. taiotaomicron是否也会利用其sRNA序列来适应环境变化，在鉴定的49个高可信度基因间sRNAs中，重点锁定了GibS (GlcNAc诱导的拟杆菌sRNA)--假定对氨基苯甲酸合酶簇(BT_0763-68)和糖原生物合成操纵子(BT_0769-71)之间编码的sRNA(图5)。在TYG培养基中，GibS高表达，特别是刚进入稳态生长阶段时。其肠道生态位内，B. thetaiotaomicron利用单糖作为信号来控制代谢模块基因的表达。GibS是B. taiotaomicron中保守的、大部分非结构化的sRNA，由特定单糖诱导产生。

GibS sRNA的保守、二级结构和表达谱

    6、对稳定生长期（内源性GibS高表达的生长阶段）的野生菌株VPI-5482、ΔgibS和gibS+的RNA进行测序分析显示缺乏GibS的情况下，4个基因被抑制，5个基因被诱导(图6)。而除了BT_0294和BT_0823外，所有这些基因在gibS+中的表达都恢复到野生菌株水平，表明了sRNA的特异性效应。为了检验观察到的GibS依赖性表达变化是否由直接的sRNA: mRNA碱基配对事件引起，我们在候选目标区域中寻找与GibS序列部分互补的区域，结果显示BT_3893和BT_0771 mRNA是GibS的直接靶点（直接碱基配对），而GibS和BT_1871之间的碱基配对可能依赖于辅助因子，即GibS对该基因的激活是间接的。

GibS可能通过直接的碱基配对调控靶基因的表达